Mtodo de Captura Hibrida, PCR e Teste Imunohistoquimico

Amanda Passarini Larissa Borges Rodrigues Luciana Nishimoto Landin Renan Gustavo Pitori Renata Azevedo

Apresentado a disciplina de Citopatologia e Citologia Clnica Professora Vlma Coli

Unip Araatuba 2013

Captura Hibrida
A captura hibrida um mtodo de diagnostico, e destaca-se por ser um teste de fcil execuo. Porm extremamente sensvel ao seu resultado. A captura hibrida capaz de diagnosticar o vrus HPV ainda que o paciente no tenha nenhum sintoma da doena. Ela capaz de classificar o vrus por grupo, conforme o grau de risco, alm de fornecer a estimativa varivel de carga viral contida na

amostra.
Um aspecto bem interessante sobre a captura hibrida, o fato dela sempre interpretar o alto risco para o cncer, uma infeco que na verdade sofre mudana do tipo viral, ao longo do tempo, por um vrus de alto risco, o que descaracteriza uma infeco persistente se tivesse sido utilizada uma tcnica que fornecesse o tipo viral especifico.

Orientaes para a realizao. Para a realizao do exame necessrio que a paciente no mantenha relaes sexuais por 3 dias antes da consulta, ela no deve estar menstruada e no ter usado nenhum tipo de ducha ou lavagem na vagina durante uma semana. Pois estes fatores podem alterar a fidelidade do exame e reproduzir um resultado errneo. Descrio do exame: Consiste em retirar uma pequena amostra do muco vaginal, que colocado em um tubo de ensaio e enviado para o laboratrio para analise posterior.

Coleta Masculina
Coletor - O espcime s deve ser colhido com o kit Digene que composto de: Um tubete com 1ml de soluo conservadora. Contm externamente um rtulo para se anotar a data da coleta e os dados de identificao do mdico(a) e do paciente Uma escova com haste longa O material da glande, sulco blano-prepucial, uretra e bolsa testicular pode ser coletado com a escova. Para a coleta uretral com escova, indica-se a utilizao prvia, por 5 minutos, de soluo lquida de lidocana a 2% sem vasoconstritor. Preferentemente, este material deve ser coletado com o Kit Swab Digene que, ao invs de escova, contm um cotonete especial de Dacron. Imediatamente aps a coleta inserir a escova/cotonete no tubete, dentro da soluo tampo. Quebrar a haste da escova/cotonete Fechar o tubete

 Agitar o coletor durante aproximadamente 30 segundos para homogeneizar a amostra Nas outras regies do pnis, deve-se umedecer a rea com soluo fisiolgica e efetuar um raspado com lmina de vidro ou bisturi. A seguir, com o auxlio da escova/cotonete, coloca-se o material e a escova/cotonete no interior do tubo O material colhido dessa forma dever ser enviado ao laboratrio o mais breve possvel. temperatura ambiente sua viabilidade de 15 dias. Quando o tempo decorrido entre a coleta e a chegada ao laboratrio for superior a esse perodo, o espcime deve ser conservado em geladeira (2 a 8 C)

Coleta Feminina
Colo Uterino e/ou Vagina Tambm coletado com o Kit Digene Coleta Esfoliado Celular necessrio abstinncia sexual de 3 dias e a paciente no deve estar menstruada No efetuar exame digital (toque), colposcopia ou assepsia prvia A presena de sangue (no menstrual) ou de contedo vaginal anmalo no altera o resultado Quando necessria (solicitada), a coleta de citologia crvico-vaginal deve preceder a da Captura Hbrida Remover, com algodo ou gaze, o excesso de muco ao redor do orifcio externo e da ectocervix Introduzir toda a escova no canal cervical e rod-la 5 vezes no sentido horrio. A seguir, escovar a ectocervix e, se desejar, as paredes vaginais Imediatamente aps a coleta inserir a escova no tubete, dentro da soluo tampo Quebrar a haste da escova Fechar o tubete.

 Agitar o coletor durante aproximadamente 30 segundos para homogeneizar a amostra O material colhido dessa forma dever ser enviado ao laboratrio o mais breve possvel. temperatura ambiente sua viabilidade de 15 dias. Quando o tempo decorrido entre a coleta e a chegada ao laboratrio for superior a esse perodo, o espcime deve ser conservado em geladeira (2 a 8 C).

Vulva Material do intrito vulvar pode ser obtido diretamente com a escova Imediatamente aps a coleta inserir a escova no tubete dentro da soluo tampo Quebrar a haste da escova Fechar o tubete Agitar o coletor durante aproximadamente 30 segundos para homogeneizar a amostra Nas outras regies, deve-se umedecer a rea com soluo fisiolgica e efetuar um raspado com lmina de vidro ou bisturi. A seguir, com o auxlio da escova, coloca-se o material e a escova no interior do tubo, efetuando-se os passos 3 e 4
Bipsia No deve ter mais que 5mm de dimetro Caso o material no seja entregue ao laboratrio dentro de 24 horas, devese congel-lo (-20C) e assim encaminhado para anlise

PCR (Reao em cadeia da polimerase)

O diagnstico do HPV pode ser feito atravs de exames colpocitolgico e histolgico. So exames que detectam com sensibilidade razovel a infeco pelo HPV, tornando-se possvel evidenciar leses ou neoplasias intraepiteliais ou carcinomas do trato genital. O diagnstico de certeza feito atravs de bipsia da rea suspeita. Alm desses exames existem outros mtodos diagnsticos como a PCR Reao em Cadeia da Polimerase. A PCR uma tcnica da Biologia Molecular que permite replicao do vrus in vitro do DNA de forma extremamente rpida. Com a PCR, quantidades mnimas de material gentico podem ser amplificadas milhes de vezes em poucas horas, permitindo a deteco rpida dos marcadores genticos de doenas infecciosas, cancro ou doenas genticas. A PCR est desenhada de acordo com o principio natural de replicao de DNA. Este um processo que decorre de trs passos, que em conjunto se designam como um ciclo e que se repete um nmero especfico de vezes. Assim, um ciclo de PCR consiste nos seguintes passos:

Desnaturao Hibridizao Extenso.

Primeira Etapa: As duplas fitas de DNA que esto unidas atravs de fracas ligaes chamadas pontes de hidrognio, so separadas por um aumento da temperatura. Segunda Etapa: Os primers se anelizam regies homlogas do DNA da fita me. Se no houver regies homlogas, eles no se anelizaro e no ocorrer a formao de uma nova fita. Portanto, no haver amplificao de DNA, no ocorrendo o aparecimento da banda correspondente em gel de agarose e poliacrilamida ou do sinal grfico no eletroferograma em sistemas automatizados.

Terceira Etapa: Uma enzima termoestvel chamada Taq DNA Polymerase age fixando os nucleotdeos na fita complementar que vai ser formada a partir da fita molde. Desta maneira, no primeiro ciclo iro se formar quatro fitas a partir das duas primeiras; no segundo ciclo iro se formar oito fitas, e assim por diante. Ao final de trinta e seis ciclos, teremos uma quantidade de fitas de DNA da ordem de 2 ou 137.438.973.472 de fitas a partir das duas primeiras. Desta forma, teremos a separao do DNA do vrus fazendo ento a colocao do vrus em alta ou baixo risco. Entretanto os de maior virulncia o 6 e 18 e os de baixo risco esto entre o 6 e 11.

Imuno Histoqumica em diagnostico Citolgico

Utilizao As reaes imuno-histoqumicas (IHQ) detectam molculas (antgenos) teciduais, sendo de grande valor nos diagnstico antomo-patolgico e nas investigaes cientfica e podem ser utilizadas nas mais diferentes situaes dentro de um laboratrio de patologia cirrgica. As mais importantes so: 1) elucidao do tecido de origem de uma neoplasia indiferenciada; 2) determinao do rgo de origem de uma neoplasia diferenciada; 3) subclassificao de linfomas; 4) pesquisa de fatores prognsticos, teraputicos e ndices proliferativos de algumas neoplasias; 5) identificao de estruturas, organismos e materiais secretados pelas clulas; 6) deteco de clulas neoplsicas metastticas

Vantagens Custo baixo e moderado Alta sensibilidade e especificidade Permite a anlise de um ou mltiplos antgenos simultaneamente Possibilidade de deteco e localizao de protenas intracelulares, bem como do trfego intracelular. (Para essa finalidade, as membranas celulares so solubilizadas com Triton. possvel analisar 1 antgeno particular em vrios tecidos em uma mesma lmina Aplicvel a clulas vivas Padronizao e realizao simples Necessidade de pequenas quantidades de tecidos

Tcnica As etapas devem ser seguidas das seguintes maneiras: 1- Colheita da amostra biolgica 2- Preservao por fixao ou congelamento em nitrognio lquido Usando fixadores: formaldedo 4 a 10%, paraformadedo 4%, periodato-lisina-paraformadedo (PLP), glutaraldedo, Carnoy (etanol: clorofrmio: cido actico galacial) 3- Desidratao realizada com lcool absoluto 4- Clareamento Utilizado Xilol e seus efeitos podem ser revertidos por tripsina 5- Incluso em blocos de parafina A temperatura no deve ultrapassar 60C 6- Obter seces em micrtomo e re-hidratar com xilol e lcool em diferentes concentraes

Referncia Bibliografica
Labortoria CDL Revista Viva Sade / Uol www.cervical.com.br www.centrodegenoma.com.br