Anda di halaman 1dari 42

Fitri Wulandari Dyan Oktavia Rindhu S.R Bernita Yanuaritmala M.

Falahudin Dianah Rosikhoh

Metode

pemisahan ini menggunakan lapisan tipis adsorben sebagai media pemisahan ( kromatografi adsorbsi) Proses isolasi yang terjadi berdasarkan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen, oleh karena daya serap adsorban terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan

Kromatografi

lapis tipis (KLT) adalah metode kromatografi sederhana-- bermanfaat untuk analisis Obat Lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang digunakan juga lebih sederhana Waktu cukup singkat (15-60 menit) Jumlah zat yang diperiksa cukup kecil (kira-kira 0,01 g senyawa murni, 0,1 g simplisia) sehingga hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat.

Penggunaan

KLT umum untuk tujuan 1.Analisa Kualitatif 2. Analaisa Kuantitatif 3. Analisa Preparatif/ analitik

Analisa

kualitatif Identifikasi senyawa: secara kualitatif mengungkapkan ada atau tidaknya sentawa tertentu dalam cuplikan Berdasarkan pada harga Rf: perbandingan jarak rambat yng dicapai oleh senyawa dengan pengembang Analisa Kuantitatif : penetapan kadar melalui penetapan visual dari ukuran bercak dibandingkan dg senyawa pembanding ketepatan rendah ( 10-30 %)

Analisa

Preparatif/ KLT analitik

Kromatografi

analitik biasanya dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan, Kromatografi preparatif dilakukan untuk memperolah fraksi murni dari campuran. Ketebalan lapisan - KLT preparatif 0,5-2 mm dg ukuran plat 20x20 am atau 20x40 cm - KLT analitik 0,1-0,2 mm umumnya 0,25 mm (untuk HPTLC/ KLTKT umumnya 0,2 mm)

1. Lebih cepat dan lebih reproducible dari kromatografi kertas. 2. Untuk menyempurnakan pemisahan, lempeng dapat dibuat dengan
campuran adsorben sebagai berikut :

a. Campuran homogen dari beberapa adsorben b. Satu lempeng dilapisi dengan adsorben yang berbeda-beda c. Satu lempeng dilapisi dengan campuran dua adsorben dengan konsentrasi bervariasi dari 0% ke 100% untuk adsorben yang satu dari ujung lempeng yang satu ke ujung lempeng yang lain dan sebaliknya. 3. Area dari bercak lebih kompak dan jenis spray-reagents lebih banyak termasuk yang bersifat korosif dapat digunakan bila adsorben bukan selulosa. 4. Identifikasi komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi atau pemadaman fluoresensi, radiasi UV

5. Dapat dilakukan elusi dengan mekanik (ascending) atau menurun (descending) atau dengan cara elusi 2 dimensi 6. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang ditentukan merupakan noda yang tidak bergerak

Kekurangan

dari teknik ini mungkin hanya pada prosedur pembuatan lempengnya yang memerlukan tambahan waktu, kecuali bila telah tersedia lempeng yang diproduksi secara komersial.

Harmita,

2006. Buku Ajar Analisis Fisikokimia. Departemen Farmasi FMIPA Universitas Indonesia

Perbedaan Analitik &Preparatif

Tujuan utama adalah untuk analisis Fase diam yang digunakan sedikit Pada aplikasinya menggunakan cara penotolan

Bertujuan untuk pemisahan/ isolasi Fase diam yang digunakan lebih banyak. Dibuat pita

Analitik

Preparatif

Pemilihan Adsorben

Faktor yang harus diperhatikan dalam pemilihan jenis adsorben : Tidak bereaksi dengan senyawa yang akan dianalisis Tidak larut dalam pelarut yang digunakan Bersifat stabil selama berlangsungnya proses pemisahan Ukuran partikel seragam

Adsorben yang umum digunakan adalah: Silika gel Alumina Tanah diatomeae Serbuk selulosa

Pemilihan Sistem Pengembang (eluen)

Tergantung sifat campuran senyawa yang akan dipisahkan, kepolaran senyawa

Menggunakan kombinasi pelarut

Dikerjakan dengan dua arah pendekatan, melalui data pustaka atau dengan coba-coba

Pemilihan Pelarut

Pada penggunaan pelarut perlu diperhatikan :


Kemurnian

Pelarut Campuran pelarut hanya boleh digunakan maksimum 2-3 kali Komposisi campuran dapat berubah karena penyerapan atau penguapan
Reaksi

satu sama lain komponen-komponen

campuran pelarut

1106010540

Lempeng

TLC yang sering digunakan ialah lempeng silika. Macam lempeng lainnya yang jarang digunakan sekarang selulosa dan poliamida

Eluen yang Dapat Digunakan

Dianah Rosikhoh 1106009223 M. Falahuddin

Diambil dari jurnal

1.
2. 3. 4.

Daun dipisahkan dari tanamannya. Dicuci dibawah air mengalir. Dikeringkan 45C di dalam oven. Kemudian daun kering dihaluskan menjadi serbuk.

1.
2. 3. 4.

Masukkan 10 gram serbuk simplisia ke dalam 100 ml methanol. Larutan dipanaskan 55C di water bath selama 5 menit. Simpan selama 1 hari Larutan kemudian dipekatkan dibawah tekanan pada suhu 45C menggunnakan rotary evaporator, hingga mencapai 1/10 volume larutan mula-mula.

Solvent yang digunakan:


Etil Asetat: Asam Asetat Glasial: Asam Formiat : Aquadest(12.1: 1.3: 1.1: 2.8)

Ukuran pelat:
3 x 10 cm (TLC Silica gel 60 F254, Merck)

1.

2.

Ekstrak diteteskan di atas pelat. Lalu pelat dielusikan ke dalam chamber yang telah jenuh dengan 10 ml solvent. Pelat diperiksa dibawah sinar UV pada panjang gelombang 366 nm. Keberadaan flavonoid dapat diperjelas dengan menyemprotkan larutan etanol 1% dalam AlCl3.

1. Ukuran

pelat: 20 x 10 cm (HPTLC Silica gel 60 F254,

Merck)
2. Pelat

diaktivasi pada suhu 110 C selama 30 menit.

3. 2000l

ekstrak diaplikasikan sebagai pita tunggal

dengan panjang 180 mm pada pelat HPLTC.


4. Pelat

dikembangkan dengan 10 ml solvent. Solvent

yang digunakan adalah Etil Asetat : Asam Asetat Glasial : Asam Formiat : Aquadest (12.1: 1.3: 1.1: 2.8).

5. Pelat diperiksa dibawah sinar UV 366 nm. Hasil:


Bercak Bercak Bercak Bercak Bercak

1: Rf = 0,15 dengan fluoresensi coklat. 2: Rf = 0,20 dengan fluoresensi biru muda.

3: Rf = 0,45 dengan fluoresensi biru muda.


4: Rf = 0,33 dengan fluoresensi biru terang. 5: Rf = 0,82 dengan fluoresensi coklat muda.

6. Pita yang berfluoresensi biru tipis dengan Rf = 0,33 dipertimbangkan sebagai kemungkinan flavonoid, sehingga dipilih untuk diisolasi.

Pelat HPLTC pada fluoresensi 366 nm

1.

Pita yang terpilih dikerok bersama dengan silikanya, menggunakan


pisau tajam dan dikumpulkan di eppendorf tube. Komponen flavonoid dielusikan dari silica gel dengan methanol, sehingga komponen flavonoid akan terlarut dalam methanol.

2.

3.

Larutan ini kemudian diuapkan pada suhu ruangan hingga volumenya


mencapai 1/3 volume awal. Dan beri nama fraksi 1. Fraksi 1 dilakukan co-kromatografi dengan ekstrak kasar untuk memastikan pitanya memiliki Rf yang sama. Hasilnya adalah pita tunggal yang tajam dan berfluoresensi biru yang diduda flavonoid.

4.

5.

Pelat HPLTC fraksi 1 pada fluoresensi 366 nm

6.

Ukur serapan pada


spektrofotometer UV Vis. Dan serapan maksimum muncul pada

365-370 nm.
7.

Fraksi 1 hanya menampilkan peak tunggal pada 370-380 nm. Dan dapat dikonfirmasi bahwa ini merupakan komponen flavonoid.

8.

Lihat struktur fraksi 1 dengan menggunakan infra merah. Hasil:


3195.74cm-1 : alkana bebas (=CH). 3423.47cm-1 : fenol atau alkohol (-OH). 1652.32cm-1 : aromatik (C=C).

Mishra, Gaurav J, dkk. 2012. Isolation of Flavonoid Constituent from Launaea procumbens Roxb. by Preparative HPTLC Method. Gujarat: Veer Narmad South Gujarat University.

Flavon

yang termetilasi atau terasetilasi tinggi dan juga flavonol eluen non polar, seperti kloroform : methanol (15 : 1) Aglikon flavonoid (apigenin, luteolin, quersetin) kloroform : methanol (96 : 4) dan eluen dengan kepolaran yang setara dengan itu Glikosida flavonoid etil asetat : asam format : asam asetat glasial : air (100 : 11 : 11 : 26) Rutin dan vitexin-2-O-rhamnoside etil asetat : etil metil keton : asam format : asam asetat glasial : air (50 : 30 : 7 : 3 : 10)

Kehati-hatian

dalam pemilihan sistem eluen dapat memisahkan glukosida flavonoid dari bentuk analog galaktosida Misal, 8-C-glucosylapigenin (vitexin) dapat dipisahkan dari 8-C-galactosylapigenin dengan eluen etil asetat : asam format : air (50 : 4 : 10)

Penyemprot

iodine spot kuning-coklat dengan latar putih Spektrofotometri UV-Vis (254 nm) dengan plat silika gel F 254 spot gelap Spektrofotometri (365 nm) kuning gelap, hijau, atau biru (tergantung jenis flavonoid)

Untuk

HPTLC Plate yang digunakan untuk tujuan pemisahan pada HPTLC silika gel 60 F 254, RP-18, Diol HPTLC Eluen (pada plat RP-18) methanol : air Glikosida yang polar memerlukan persentase air yang besar sehingga didesain plat HPTLC yang khusus,

hasil yang lebih pasti, bisa digunakan

Sumber : Andersen, Oyvind M., Kenneth Markham. 2006. Flavonoids : Chemistry, Biochemistry, and Applications. Boca Raton : CRC Press.