UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS GRADUAO EM BIOTECNOLOGIA DISCIPLINA DE BIOLOGIA MOLECULAR

VARIAES DE PCR PCR IN SITU HOT-START PCR

Carolina Dupke Natlia Segatto Willian Costa

PCR In Situ
Reao da cadeia polimerase que ocorre dentro da clula (lmina de tecido ou clulas isoladas). PCR In Situ (direto)
PCR Hibridizao In Situ (indireto) PCR RT In Situ

PCR In Situ -Direto

Nucleotdeos macados so incorporados na

amplificao (digoxigenin-11-dUTP, fluoresceindUTP) Analisados por Imunohistoqumica.

PCR Hibridizao In Situ

A hibridizao in situ uma tcnica

baseada na deteco de pequenos segmentos de DNA ou RNA a partir de "sondas" especficas. A reao PCR in situ uma tcnica molecular que combina a extrema sensibilidade da PCR, com a localizao anatmica fornecida por hibridao in situ .

RT- PCR In Situ

Combinao entre a PCR In Situ

e a transcrio reversa. Difere da PCR In Situ normal em dois passos: na digesto com DNase e na etapa de transcrio reversa.

Detection of by in situ RT-PCR. a) Localization of adrenomedullin mRNA in human bronchial glands. This regulatory peptide has been recently described in normal lung and in pulmonary tumors (6). b) Serial section of the same gland used as a negative control, primers were substituted by water in the PCR mixture. http://www.nih.gov/catalyst/back/95.05/rmet.html

Aplicaes
Deteco de DNA viral (CMV, HPV,

HIV); Estudo de rearranjos de DNA e translocaes cromossmicas; RNA viral (RT- PCR In Situ). Produtos da sntese celular. Permite a localizao de sequncias especficas dentro de populaes de clulas, como tecidos e amostras de sangue.

Desvantagens
O tempo maior que o da PCR

convencional (1 ciclo leva 15 minutos, enquanto o da PCR comum leva 1 minuto), devido barreira fixa da clula.

HOT START PCR DEFINIO

Hot Start PCR uma simples modificao do

processo de PCR original em que a reao de amplificao iniciado com uma temperatura elevada.

CARACTERISTICA
Hot Start PCR reduz a amplificao no-especfica e

aumenta o rendimento da PCR-alvo do produto. Hot Start PCR permite a inibio da atividade da polimerase PCR durante a preparao da reao.

Como acontece?
A reao de PCR ativada quando a temperatura

atinge 94 Graus. Esse procedimento aumenta a especificidade da PCR, pois a DNA polimerase s ativada ao atingir essa temperatura.

VANTAGENS
Especificidade.

Sensibilidade.
Rentabilidade.

Desvantagens
Maior risco de contaminao.

Em casos de enzimas especiais prontas o processo

encarece.

Aplicaes
Testes genticos

Diagnostico Clinico
Exames de sangue Forense

Exemplos

Referncias
http://www.nih.gov/catalyst/back/95.05/rmet.html

http://www.nature.com/nprot/journal/v2/n11/fig_t

ab/nprot.2007.395_F1.html