Anda di halaman 1dari 11

PCR

(Polimerized Chain Reaction)

Real-Time PCR
Metode kuantifikasi akurat jumlah nilai awal DNA, cDNA, RNA. Alat ini mendeteksi reaksi melalui akumulasi sinyal fluorescent. qPCR pada umumnya men jalani 40 siklus amplifikasi

Real-Time PCR
Mesin PCR mendeteksi flourescence dan software akan mengkalkulasi nilai CT dari intensitas fluorescence Produk PCR terdeteksi melalui: SYBR green atau fluorescently labelled sequence-specific probes

SYBR Green
SYBR green merupakan pengganti ethidium bromida Bahan ini digunakan pada metode Real-Time PCR SYBR green berikatan dengan double-stranded DNA, ikatan ini menyebabkan SYBR green untuk ber-fluoresce; dalam hal ini mengabsorbsi warna biru dan menghasilkan warna hijau

Cycle Threshold (CT)


CT mengindikasikan jumlah siklus dimana jumlah salinan yang teramplifikasi telah mencapai threshold tetap yaitu saat flourescent yang dihasilkan dalam reaksi melewati threshold CT berbanding terbalik dengan jumlah DNA sampel

Cycle Threshold (CT)


Nilai CT dan artinya: <= 29 , target DNA pada sampel banyak 30-37, sedang 38-40, lemah atau dapat merepresentasikan suatu keadaan yang terkontaminasi

Metode dalam Real-Time PCR


One- Step RT PCR Penanganan yang cenderung lebih mudah Prosedur lebih cepat Two-Step RT PCR Beberapa transkrip berbeda dapat dianalisis oleh PCR dalam suatu reaksi Fleksibilitas dalam peilihan RT primer

Tingkat reproduksi lebih tinggi


Resiko kontaminasi lebih rendah

Memungkinkan penyimpanan cDNA dalam waktu lama

Jenis Kuantifikasi
Kuantifikasi Absolut = penggunaan standard Kuantifikasi Relatif = kalkulasi ekspresi gen melalui penentuan rasio sebuah gen target dengan sebuah gen refrensi endogenous yang terdapat dalam semua sampel

Deskripsi
Threshold: disesuaikan pada sebuah nilai yang berada diatas background dan secara signifikan dibawah plateau dari sebuah plot amplifikasi. Threshold harus terletak dalam daerah linear pada sebuah kurva amplifikasi Delta CT: perbedaan antara nilai Ct gen target dan nilai Ct gen refrensi endogenous Delta delta Ct: perbedaan nilai rata-rata Ct sebuah sampel target dengan sebuah sampel refrensi

Deskripsi
Gen refrensi endogenous: sebuah gen yang tingkat ekspresi tidak berbeda antara sampel No template control (NTC): sebuah reaksi kontrol yang mengandung semua komponen untuk reaksi amplifikasi kecuali templatenya; untuk mendeteksi kontaminasi Standard: sampel yang diketahui besar konsentrasinya Kurva standard: dibuat menggunakan serial delution paling sedikit 5 konsentrasi standard berbeda.