Penentuan aktivitas hemolitik

Banyak bahan tanaman obat, terutama yang berasal dari keluarga Caryophyllaceae, Araliaceae, Sapindaceae, Primulaceae, dan Dioscoreaceae mengandung saponin. Properti yang paling khas dari saponin adalah kemampuan mereka untuk menyebabkan hemolisis: ketika ditambahkan ke suspensi darah, saponin menghasilkan perubahan dalam membran eritrosit, menyebabkan hemoglobin untuk berdifusi ke dalam medium sekitarnya.

 Aktivitas hemolitik bahan tanaman, atau sediaan yang mengandung saponin, ditentukan oleh perbandingan dengan yang dari bahan referensi, saponin R, yang memiliki aktivitas hemolitik dari 1000 unit per g. Suspensi eritrosit dicampur dengan volume yang sama dari seri pengenceran ekstrak bahan tanaman. Konsentrasi terendah untuk mempengaruhi hemolisis lengkap ditentukan setelah memungkinkan campuran untuk berdiri untuk jangka waktu tertentu. Sebuah tes serupa dilakukan bersamaan dengan saponin R.

 Prosedur yang diusulkan untuk penentuan aktivitas hemolitik bahan tanaman obat bersifat saponin semua didasarkan pada prinsip yang sama meskipun rincian mungkin berbeda, misalnya sumber eritrosit, metode untuk penyusunan suspensi eritrosit dan ekstrak bahan tanaman, aktivitas hemolitik ditetapkan dari bahan referensi dari saponin, dan metode eksperimental. Untuk mendapatkan hasil yang dapat diandalkan, adalah penting untuk melakukan standarisasi kondisi eksperimental, dan terutama untuk menentukan aktivitas hemolitik dibandingkan dengan yang dari saponin R.

prosedur yang Dianjurkan

Untuk mempersiapkan suspensi eritrosit mengisi botol kaca tutup untuk sepersepuluh dari volume dengan natrium sitrat (36,5 g / l) TS, berputar-putar untuk memastikan bahwa bagian dalam labu benar-benar basah. Memperkenalkan volume yang cukup dari darah segar yang dikumpulkan dari sapi yang sehat dan kocok segera. Darah sitrat disiapkan dengan cara ini dapat disimpan selama sekitar 8 hari pada 2-4 C. Tempatkan 1 ml darah sitrat dalam labu volumetrik 50 ml dengan pH dapar fosfat 7,4 TS dan hati-hati encer dengan volume. Ini suspensi darah diencerkan (2% larutan) dapat digunakan asalkan cairan supernatant tetap jelas dan tidak berwarna. Ini harus disimpan pada suhu dingin.

 Untuk mempersiapkan solusi referensi, mentransfer sekitar 10 mg saponin R, akurat ditimbang, ke dalam labu ukur dan menambahkan cukup pH dapar fosfat 7,4 TS untuk membuat 100ml. Solusi ini harus baru disiapkan secara. Ekstrak bahan tanaman dan pengenceran harus disiapkan sebagaimana ditentukan dalam prosedur tes untuk bahan tanaman yang bersangkutan, dengan menggunakan pH dapar fosfat 7,4 TS.

uji pendahuluan
Siapkan pengenceran serial tanaman ekstrak bahan dengan pH dapar fosfat 7,4 TS dan suspensi darah (2%) menggunakan empat tes-tabung seperti ditunjukkan pada Tabel 3. Begitu tabung telah disusun, lembut membalikkan mereka untuk mencampur, menghindari pembentukan busa. Kocok lagi setelah interval 30 menit dan memungkinkan untuk berdiri selama 6 jam pada suhu kamar. Periksa tabung dan merekam pengenceran di mana total hemolisis telah terjadi, ditandai dengan, solusi merah yang jelas tanpa deposit eritrosit. Lanjutkan sebagai berikut.

 Jika jumlah hemolisis diamati hanya dalam tabung no. 4, menggunakan ekstrak tanaman bahan asli langsung untuk uji utama. Jika jumlah hemolisis diamati pada tabung 3 dan 4, menyiapkan pengenceran dua kali lipat dari tanaman ekstrak bahan asli dengan dapar fosfat pH 7,4 TS. Jika jumlah hemolisis diamati pada tabung 2, 3 dan 4, menyiapkan pengenceran lima kali lipat dari tanaman ekstrak bahan asli dengan dapar fosfat pH 7,4 TS. Jika, setelah 6 jam, keempat tabung berisi, solusi merah yang jelas, menyiapkan pengenceran sepuluh kali lipat dari tanaman ekstrak bahan asli dengan pH dapar fosfat 7,4 TS dan melaksanakan tes awal lagi seperti dijelaskan di atas. Jika jumlah hemolisis tidak diamati dalam salah satu tabung, ulangi uji pendahuluan menggunakan ekstrak bahan tanaman lebih terkonsentrasi.

uji utama
Siapkan pengenceran serial tanaman ekstrak bahan, murni atau diencerkan dengan menghalangi-ditambang oleh tes awal, dengan pH dapar fosfat 7,4 TS dan suspensi darah (2%) menggunakan 13 tabung-tabung uji seperti yang ditunjukkan pada Tabel 4. Melaksanakan pengenceran dan evaluasi seperti pada tes awal tapi mengamati hasil setelah 24 jam. Hitung jumlah bahan tanaman obat di g, atau persiapan dalam g atau ml, yang menghasilkan jumlah hemolisis. Untuk menghilangkan efek dari variasi individu dalam ketahanan suspensi eritrosit solusi saponin, menyiapkan serangkaian pengenceran saponin R dengan cara yang sama seperti dijelaskan di atas untuk ekstrak bahan tanaman. Hitung jumlah saponin R di g yang menghasilkan jumlah hemolisis