ASCENCIO JIMENEZ ATAI ZISA DE LA CRUZ SOTO REYNA JUDITH DENISSE ALOR ANA PAULINA LUIS GONZALEZ PACO

ALFREDO RAMOS LARA YOKOBED REYES BONIFANT GERARDO RUIS CIGARROA DANIEL ENRIQUE SAUCEDO MACHUCHO DEKART RAMN

MENU
Exmenes de sangre Muestras fecales Procedimiento formalina-ter Mtodo de Faust Tincin tricrmica de Wheatley Tcnica de Graham Reacciones del colorante tricrmico Mtodos de inmunodiagnstico

PARA EL DIAGNSTICO DE LAS INFECCIONES POR PARSITOS DE LA SANGRE SE PREPARAN DOS TIPOS DE PELCULA DE SANGRE:
PLICULAS FINAS: la sangre se distribuye por el portaobjetos en una capa delgada y los eritrocitos estan intactos despues de la tincin.

PELCULAS GRUESAS: conocida como gota gruesa, la sangre se concentra en una zona pequea y tiene el grosor de muchas capas de clulas.
Durante la tincin, los eritrocitos se lisan y solo sern visibles los leucocitos y los parsitos.

Men

La sangre para el examen se puede obtener por puncin digital.

La primera gota , libre de anticoagulante, se utiliza para preparar la pelcula. Las pelculas, especialmente para el diagnstico de la malaria, no deben prepararse con sangre con anticoagulante o coagulada. Si se emplea alcohol al 70% para desinfectar el punto de la puncin, debe enjuagarse o permitir que el alcohol se seque para asegurar que no fija las clulas hemticas y evitar una deshemoglobinizacin en las pelculas finas

Las pelculas gruesas pueden prepararse tocando la superficie inferior de una gota de sangre con la punta del dedo y rotando el porta hasta cubrir una superficie del tamao de 1,5 cm.

Un mtodo alternativo consiste en reunir algunas gotas pequeas con el borde del porta.

Las pelculas gruesas o finas pueden prepararse en portas diferentes o en el mismo con una pelcula fina en un extremo y una gruesa en el otro. En estos casos, solo la pelcula fina se debe fijar con alcohol metlico (30 seg.)Y ha de evitarse el contacto de la pelcula gruesa con el vapor del alcohol.
Las pelculas gruesas deben dejarse secar a temperatura ambiente, generalmente durante le noche. Un exceso de temperatura puede fijar los eritrocitos y evitar la deshemoglobinizacin.

La tincin se realiza especialmente con el colorante de Giemsa. Para las capas finas se puede utilizar la tincin de Wright, aunque tie los parsitos peor que el colorante de Giemsa. En la actualidad se dispone de una serie de tinciones de Giemsa rpidas; sin embargo, stas no tien los parsitos del paludismo como el mtodo de Giemsa tradicional. Una solucin de Colorante de Giemsa que acte adecuadamente debe prepararse cada da diluyendo el colorante de Giemsa con agua tamponada con fosfato M/15, pH 7 a 7,2.

Se mezclan una parte del colorante con 50 partes de agua en un tarro de Coplin y se tien los portaobjetos durante 50 min.

Despus de la tincin, las pelculas se enjuagan sumergiendo brevemente los portas en agua tamponada.

Se deja secar los portas al aire y despus se examinan con iluminacin tenue para buscar microfilarias y con alta intensidad lumnica e inmersin en aceite para buscar protozoos en la sangre y los tejidos

MUESTRAS FECALES
Recogida Y Manipulacin De Las Muestras Examen General Exmenes Microscpicos

Men

MUESTRAS FECALES

El diagnostico de laboratorio correcto y oportuno depende del cuidado con que se realice la toma, manejo y envo de muestras.

Los laboratorios que realizan exmenes de heces para detectar parsitos deben ser capaces de efectuar exmenes directos, un procedimiento de concentracin y un mtodo de tincin permanente.

TOMA DE MUESTRAS

Las muestras fecales pueden ser obtenidas en recipientes limpios de boca ancha y con tapa hermtica que permitan su fcil transporte.

Las heces obtenidas del suelo, excusado as como del paal no son satisfactorias, debido a que pueden contaminarse con material extrao.

Recoleccin de muestras en adultos y nios

Se pueden recoger las heces con la ayuda de un envoltorio plstico que se coloca suelto sobre el inodoro y se sostiene en su lugar con el asiento. Deber seleccionarse una muestra del tamao del hueso de un durazno (en caso de heces slidas); o 1 2 tomas con cuchara (en caso de diarreas)

Recoleccin de muestras en bebs y nios pequeos en paales

Se debe cubrir el paal con un envoltorio plstico de manera que las heces queden separadas de cualquier salida de orina. Deber seleccionarse con una cuchara de 1 a 2 gramos de heces, las cuales sern depositas en el envase en el que se transportarn.

Transporte de Muestras

El recipiente que contiene la muestra debe enviarse al laboratorio antes de transcurridos 30 minutos si no contiene conservador.

EXAMEN GENERAL
Se realiza a simple vista, para ello se extienden las heces en una placa de Petri y se observa: Cantidad Color Olor Forma y Consistencia Tambin podemos observar a simple vista fragmentos de fcula, grasas neutras, moco, pus, sangre, etc.

EXMENES MICROSCPICOS
Las muestras pueden ser observadas microscpicamente mediante montajes hmedos directos de material fresco o conservado, montajes concentrados o tinciones permanentes. Cada procedimiento especificas: tiene sus ventajas

Montajes Hmedos

Los montajes hmedos directos en suero fisiolgico de heces frescas permiten la deteccin y observacin de trofozoitos protozoarios y larvas de helmintos mviles. Los montajes directos de heces conservadas pueden permitir la deteccin de parsitos que no se concentran bien.

Montajes Concentrados

Los procedimientos de concentracin aumentan la probabilidad de detectar quistes de protozoos y los huevos y las larvas de helmintos, pero por lo general no son satisfactorios para la deteccin de los trofozoitos protozoarios.

Tinciones Permanentes

Las tinciones permanentes son tiles para la deteccin y el examen morfolgico de los trofozoitos y quistes de los protozoos

Exmenes Microscpicos

Las muestras de heces formadas han de ser examinadas por concentracin. Las heces blandas y diarreicas deben examinarse por concentracin y procedimientos de tincin definitiva. En caso de que sean recientes se examinarn por preparacin hmeda directa. Las deposiciones acuosas se examinaran mediante tinciones permanentes y preparaciones hmedas directas.

EXMENES MICROSCPICOS
Hmedos Procedimientos De Concentracin
Montajes

MONTAJES HMEDOS

Los montajes hmedos directos o de material concentrado se realizan utilizando portaobjetos de 5 por 7,5 cm. y un cubreobjetos del no. 1 de 22 mm. Se realizarn dos montajes, uno sin teir y otro teido con una gota d solucin yodada. El yodo debe ser de Dobell y OConnor o una dilucin yodada al 1:5 de Lugol. El montaje sin teir de heces frescas se debe realizar en suero fisiolgico (0,85%)

Se debe examinar microscpicamente el preparado de tal modo que sea observada sistemticamente toda la superficie del cubreobjetos.

Un mtodo consiste en empezar en un ngulo y utilizando la platina, mover arriba y debajo de tal modo que cada campo pueda ser observado metdicamente con el objetivo de X 10 y X 40

PROCEDIMIENTOS DE CONCENTRACIN
Los procedimientos de concentracin aumentan la capacidad de deteccin de quistes de protozoos y huevos y larvas de helmintos mediante la disminucin del material de fondo en la preparacin y una concentracin real de los organismos. Los procedimientos de concentracin se pueden llevar a cabo en muestras frescas o conservadas.

Los mtodos de concentracin emplean generalmente la sedimentacin o la flotacin. En la sedimentacin los parsitos mas pesados se depositan en el fondo debido a la gravedad o centrifugacin. En la flotacin los parsitos suben a la superficie de una solucin de alto peso especifico.

Los procedimientos mas utilizados son:

La

tcnica de flotacin centrifuga con sulfato de cinc, de Faust tcnica de sedimentacin en formalina ter de Ritchie o sus modificaciones.

La

La tcnica de sedimentacin con formalina ter tiene una mayor sensibilidad para detectar la mayora de los parsitos, pero requiere el uso de ter, lo cual puede presentar problemas de conservacin, manipulacin y realizacin.

El mtodo de sulfato de cinc formol resulta eficaz ya que la fijacin en este ultimo hace que disminuya la distorsin de huevos, quistes y larvas, y evita el hinchamiento de los oprculos, problemas que pueden surgir si se utiliza una concentracin de sulfato de cinc con la muestra en fresco.

Procedimiento de la

formalina-ter

Men

Introduccion
N

Es un procedimiento de concentracin Eficaz en la obtencin de:

@

Quistes de protozoos Huevos y larvas de helmintos

Sin embargo pueden pasar inadvertidos:

@
@

Los huevos de Hymenolepsis nana La concentracin de Giardia lamblia no sea buena

Paso 1
N

Desmencese una porcin de unos 2cm de dimetro en suero fisiolgico suficiente

Paso 2
N

Se cuelan unos 10ml de la suspensin a travs de un embudo con dos capas de gasa hmeda Se coloca en una centrifugadora

Paso 3
N N

Centrifguese durante 1 a 2 minutos a 650g. Decntese el liquido sobredrenante

Paso 4
N

Resuspndase el sedimento en suero fisiolgico fresco, centrifguese y vulvase a decantar.

Paso 5
N N

Se aaden unos 9 ml de formalina al 10% al sedimento. Se mezcla bien y se deja reposar 5 min.

Paso 6

Se aaden 3 ml de acetato de etilo, se tapona el tubo y se sacude vigorosamente durante por lo menos 30 seg.

Paso 7
N

Centrifguese durante 1 min. A 450-500 g.

@

Se deben formar cuatro capas, como sigue:

p p p p

Capa de acetato de etilo Tapn de desechos Capa de formalina Sedimento

Paso 8

Extrigase el tapn de residuos de los lados del tubo mediante un bastoncito aplicador y decntese cuidadosamente para eliminar las tres capas superiores.

Paso 9

Con una pipeta se mezclara el sedimento restante con la pequea cantidad de liquido que se desliza por las paredes del tubo Se preparan montajes sin teir y coloreados con yodo Se procede a su examen microscpico

Paso 10

Se preparan montajes sin teir y coloreados con yodo Se procede a su examen microscpico

PROCEDIMIENTO DE FLOTACIN CON FORMALINA-SULFATO DE CINC.

Men

El formol hace que la muestra sea mas clara y evita el estallido del oprculo y la distorsin de los parsitos. Este mtodo nos da buenos resultados para reconocer los huevos de esquisostoma.

1.-Se cuela la suspensin bien mezclada de suspensin fecal a travs de una capa de gasa en un tobo con fondo redondeado de 100 por 16 mm hasta 2 mm del borde ( la muestra debe haber sido fijada en formalina por lo menos 30min.)

2.- Centrifguese durante 3,5 min. a 750 g. se debe utilizar una centrifugadora de suspensin libre.

3.- Decntese el sobrante de cada tubo, virtase la ultima gota sobre una seccin limpia de una toalla de papel y colquese el tubo recto en un estante de tubos.

4.- Adase sulfato e cinc hasta 2,5 cm. del borde de cada tubo. Para preparar la solucin de sulfato de cinc de disuelven 400 g de ZnSO4 en 1L de agua . Se comprueba el peso especifico con un buen hidrometro y se ajusta si es necesario. Se conserva en un recipiente hermticamente cerrado.

5.- Se mezcla el sedimento por completo con dos bastoncillos de aplicacin hasta que no queden fragmentos gruesos.

6.- Inmediatamente se centrifuga durante 1 o 1.5 min. a 500 g en una centrifugadora de suspensin libre.

7.- As que la centrifugadora se ha detenido por completo, se colocaran los tubos en un estante. Debe evitarse alterar la pelcula de la superficie, que ahora contiene los parsitos flotantes.

8.- Se dejara reposar los tubos por 1 min; entonces, se trasfieren dos contenidos de un asa de pelcula superficial a las gotas correspondientes desuero fisiolgico o de yodo de Dobell y OConnor en un porta objetos de vidrio de 5 x 7cm. El asa de metal debe estar en un ngulo recto con el soporte metlico. Tquese cuidadosamente el la pelcula con el asa sin introducirla en el liquido y deposite la gota del asa junto al suero fisiolgico. Entonces, utilizando la base del asa, mezcle las gotas de materia fecal con el suero y luego con la solucin yodatada.

9.- Colquese un cubreobjetos de 22 a 30mm, sobre el montaje liquido, evitando atrapar burbujas de aire.

10..- Flamese el asa metlica y procdase entonces a realizar los pasos 8 y 9 en el tubo siguiente.

11..- Colquese cada montaje preparado en el portaobjetos en una placa de Petri que contenga un papel mojado para evitar la desecacin.

12.- Examnese los montajes inmediatamente o por lo menos antes de 1 hora. Un tiempo de conservacin ms dilatado puede hacer difcil la identificacin de algunos estadios.

TINCIN TRICRMICA DE WHEATLEY

Permite colorear las estructuras internas de protozoos para su caracterizacin. Utiliza muestras fecales frescas, preservadas con PVA o fijadas con Schaudinn.

Mtodo rpido y sencillo y de utilidad en el estudio de:

Entamoeba Giardia

Balantidium Criptosporidium

Men

Materiales
Lminas portaobjetos Laminillas cubreobjetos Asa de platino Cytoseal Xilol Alcoholes 85%,90%.

Estilete curvo o pinza curva

Agua destilada Tintura de Yodo

Colorante chromotrope
Acido actico Solucin Schaudinn

Frascos coplin o placas petri.

Procedimiento Preparar un set de placas petri con los reactvos correspondientes. Sujetar la laminilla con el porta laminillas y con el estilete hacer el frotis fino de la muestra sobre la laminilla. Fijar la muestra con solucin Schaudinn por 2 a 5 minutos. Pasar por alcohol 70% con 2 o 3 gotas de tintura de yodo. Pasar por 1 minuto por alcohol 70%

Pasar por l colorante chromotrope 8 a 15 minutos Pasar por alcohol 90% con cido actico al 1% por 10-15 seg. Y ver tono de coloracin. Pasar por alcohol 95% y alcohol absoluto por 3 minutos. Pasar por xilol 1-5 minutos. No debe verse opaco. Realizar el montaje con cytoseal.

Observacin Observar con objetivo de inmersin 100x. El citoplasma de los parsitos se tie de color verde y el ncleo de color rosado.

Tincin de Wheatley elaborada a partor de muestra fecal fijada con APV

Resultado. Informar el nombre del parsito y su estadio evolutivo.

TECNICA DE GRAHAM PARA LOMBRI

Men

Se coloca un trozo de cinta de celulosa transparente de una longitud de 6 a 7 cm en un porta de cristal, comenzando en uno de sus extremos.

Procedimiento:

Una pequea porcin del extremo se dobla sobre si misma, lo que permite una superficie no pegajosa para poder mantener la tira con la mano.

Para obtener una muestra, se tira del extremo doblado, de tal manera que el extremo adhesivo de la cinta quede libre, dejando suficiente espacio del porta.

Se pone la cinta sobre el final del porta, de modo que se oculte el lado adhesivo. Se mantiene el porta con el dedo pulgar y el segundo dedo y la cinta con la ua.

Se presiona la superficie adhesiva sobre el lado derecho y el izquierdo de los pliegues perianales, pero sin insertar el porta en el recto.

Se vuelve a colocar la cinta sobre el porta (este porta se puede llevar al laboratorio o remitir al correo) Se desliza hacia atrs la cinta sobre el porta y se deja una pequea porcin pegada. Se aade una gota de tolueno y se vuelve a colocar la cinta adhesiva en el porta. (El tolueno decolora cualquier cosa, excepto los huevos y adultos en caso de estar presentes.

Se alisa la cinta con un trozo de gasa, que debe ser desinfectada y eliminada. Se efecta un examen en busca de huevos y hembras adultas con un objetivo de bajo aumento.

Nota: recurdese que los huevos de oxiuros son infecciosos, por lo que las muestras deben tratarse con cuidado para evitar infecciones.

REACCIONES DEL COLORANTE TRICROMICO

Men

En las reacciones del colorante tricromico los organismos, especialmente los trofozoitos de las muestras blandas o liquidas , se colorean a menudo mejor que los que provienen de muestras formes.

El citoplasma de los quistes fijados y bien teidos y de los trofozoitos es azul verdoso con matiz purpreo.

Preparacin de las soluciones

Solucin n 1: fijador de Shaudinn. *Alcohol etlico al 95%, 1 parte. *Cloruro de mercurio acuoso saturado, 2 partes. Solucin n 2: Fijador de PVA: * Se hace aadiendo 5gr de alcohol polivinilico en polvo(PVA), a 100 ml de fijador de Shaudinn modificado. * Se calienta a 75C, disolviendo hasta que la solucin se aclare y se enfra a temperatura ambiente.

Solucin n 3: alcohol yodado. *Aadase suficiente yodo en cristal a alcohol al 70% hasta conseguir una solucin oscura concentrada. *Para su utilizacin se diluye algo de la solucin anterior en alcohol al 70% hasta obtener una solucin de color t oscuro. Solucin n 4: Colorante tricrmico. *Materiales: Cromtropo 2R: 0,6g. Verde claro SF: 0,15g. cido fosfotungstico: 0,7g. cido actico (glacial): 1ml Agua destilada: 100 ml.

*Colquense los colorantes secos en un frasco limpio y seco. *Adase el cido glacial, agtese y humedzcase todo el polvo colorante. *Se deja reposar la mezcla durante 30 min. Se aade el agua destilada y se agita fuertemente hasta mezclar por completo. *La tincin es prpura y se puede encontrar preparado en distintas firmas comerciales. Solucin n 5: Alcohol acidificado. *Acido actico: 0,45 ml. *Alcohol etlico al 90%: 99,55 ml.

METODOS DE INMUNODIAGNOSTICO
Tecnicas de inmunoprecipitacin e inmunodifusin. Inmunohistologa Citmetro de flujo Tcnica de ELISA Westernblot Radioinmunoanlisis Fijacin del complemento

Neutralizacin e inhibicin de la hemaglutinacin

Aglutinacin con ltex
Men

Serologa

Las tcnicas inmunolgicas se utilizan para detectar, identificar y cuantificar antgenos en muestras clnicas, as como para evaluar la respuesta de anticuerpos a la infeccin y la historia de un individuo de exposicin a agentes infecciosos. La especificidad de la interaccin antgeno-anticuerpo y la sensibilidad de muchas de las tcnicas inmunolgicas hace que sean poderosas herramientas de laboratorio. En la mayora de los casos, se puede utilizar la misma tcnica para evaluar el antgeno y el anticuerpo.

TECNICAS DE PRECIPITACION E INMUNODIFUSION

Los complejos antgeno-anticuerpo especficos y las reacciones cruzadas se pueden distinguir por tcnicas de inmunoprecipitacin. Dentro de un intervalo limitado de concentracin tanto de antgenos como de anticuerpos denominado zona de equivalencia, el anticuerpo une cruzada mente al antgeno a un complejo que es demasiado grande para permanecer en solucin y, por tanto, precipita. Esta tcnica se basa en la naturaleza multivalente de las molculas de anticuerpos (p. Ej., la inmunoglobulina [Ig] G tiene dos zonas de unin al antgeno). Los complejos antgeno-anticuerpo son solubles con ndices de concentracin de antgeno con respecto a anticuerpo que estn por encima y por debajo de la concentracin de equivalencia.

INMUNODIFUSION RADIAL SIMPLE

La inmunodifusin radial simple se puede utilizar para detectar y cuantificar un antgeno. En esta tcnica, el antgeno se coloca en un pocillo y se le deja difundir en un agr que contenga anticuerpo. Cuanto mayor es la concentracin del antgeno, ms lejos difunde hasta alcanzar la equivalencia con el anticuerpo en el agar y precipita en forma de anillo alrededor del pocillo.

DIFUSION INMUNODOBLE DE OUCHTERLONY La tcnica de difusin inmunodoble de Ouchterlony se utiliza para determinar la relacin de diferentes antgenos. En esta tcnica se colocan soluciones de antgeno y anticuerpo en pocillos separados hechos en agar y se hace que difundan uno hacia el otro para establecer los gradientes de concentracin de cada sustancia. Donde las concentraciones alcanzan la equivalencia se produce una lnea visible de precipitacin. Basndose en este patrn de lneas de precipitacin, esta tcnica tambin se puede utilizar para determinar si las muestras son idnticas, si comparten alguno, pero no todos, los eptopos (identidad parcial), o son diferentes. Esta tcnica se usa para detectar anticuerpos de antgenos fngicos (p. Ej., especies de Histoplasma, especies de Blastomyces, coccidioidomicosis ).

En otras tcnicas de inmunodifusin, el antgeno se puede separar por electroforesis en agar y despus hacer reaccionar con el anticuerpo (inmunoelectroforesis), se puede transferir por medio de electroforesis a agar que contiene anticuerpos (electroforesis en cohete), o el antgeno y el anticuerpo se pueden colocar en pocillos separados y dejar que se desplacen electroforticamente el uno hacia el otro (contrainmunoelectroforesis).

Anlisis de antgenos y anticuerpos por inmunoprecipitacin. La precipitacin de la protena se produce en el punto de equivalencia, en el cual el anticuerpo multivalente forma grandes complejos con el antgeno. A, difusin inmunodoble de Ouchterlony el antgeno y el anticuerpo difunden desde pocillos, se encuentran y forman una lnea de precipitacin. Si se colocan antgenos idnticos en pocillos adyacentes, la concentracin de antgenos entre ellos se duplica, y no se produce precipitacin en esta regin. Si se utilizan diferentes antgenos, se producen dos lneas diferentes de precipitacin. Si una muestra comparte antgeno (1/2) pero no es idntico, se producir una nica lnea para la totalidad del antgeno. B, contrainmunoelectroforesis. Esta tcnica es similar al mtodo de Ouchterlony, pero el movimiento del antgeno es facilitado por electroforesis. e, inmunodifusin radial simple. Esta tcnica implica la difusin del antgeno en un gel que contiene anticuerpos. Los anillos de precipitacin indican un reaccin inmune y el rea del anillo es proporcional a la concentracin del antgeno. D, electroforesis en cohete. Los antgenos se separan por electroforesis en un gel de agar que contiene anticuerpos. La longitud del cohete indica la concentracin del antgeno. E. inmunoelectroforesis. Se coloca el antgeno en un pocillo y se separa por electroforesis. Despus se coloca anticuerpo en un surco y se forman lneas de precipitacin a medida que el antgeno y el anticuerpo difunden el uno hacia el otro.

INMUNOANALISIS PARA ANTIGENOS ASOCIADOS A CELULAS (INMUNOHISTOLOGIA) Los antgenos existentes en la superficie o en el interior de la clula se pueden detectar por inmunofluorescencia o enzimoinmunoanlisis (EIA). En la inmunofluorescencia directa una molcula fluorescente se une de forma covalente al anticuerpo (p. Ej., anticuerpo antivrico de conejo marcado con isotiocianato de fluorescena). En la inmunofluorescencia indirecta se utiliza un segundo anticuerpo fluorescente especfico para el anticuerpo primario (p. Ej., anticuerpo de cabra anticonejo marcado con isotiocianato de fluorescena) para detectar el anticuerpo antivrico primario y localizar el antgeno. En el ElA, una enzima como la peroxidasa de rbano picante o la fosfatasa alcalina se conjugan con el anticuerpo y convierten un sus trato en un cromforo para marcar el antgeno. Estas tcnicas son tiles para el anlisis de muestras de biopsias tisulares, clulas sanguneas y clulas de cultivo tisular.

Inmunofluorescencia e inmoanlisis enzimtico para la localizacin de antgenos en clulas. El antgeno se puede detectar por anlisis directo con anticuerpos vricos modificados de forma covalente con una enzima o una sonda fluorescente, o por anlisis indirecto utilizando un anticuerpo antivrico y una antiinmunoglobulina modificada qumicamente. La enzima convierte el sustrato en un precipitado, cromforo o luz.

CITOMETRO DE FLUJO

El citmetro de flujo se puede utilizar para analizar la inmunofluorescencia de clulas en suspensin y es especialmente til para identificar y cuantificar linfocitos (inmunofenotipificacin). En el citmetro de flujo se utiliza un lser para excitar el anticuerpo fluorescente unido a la clula y determinar el tamao de la clula por medio de mediciones de dispersin de luz. Las clulas fluyen a travs del lser a velocidades de ms de 5.000 clulas por segundo y el anlisis se efecta electrnicamente. El seleccionador de clulas activadas por fluorescencia (SCAF) es un citmetro de flujo que tambin puede aislar subpoblaciones especficas de clulas para su crecimiento en cultivo tisular basndose en su tamao e inmunofluorescencia.

Los datos obtenidos de un citmetro de flujo usualmente se presentan en forma de histograma con la intensidad de fluorescencia en el eje xy el nmero de clulas en el eje y, o en forma de un diagrama de puntos en el cual se compara ms de un parmetro para cada clula. El citmetro de flujo puede efectuar un anlisis diferencial de leucocitos y comparar poblaciones de clulas T CD4 y CD8 simultneamente. La citometra de flujo tambin es til para analizar el crecimiento celular despus de marcar con fluorescencia el ADN u otras aplicaciones de la fluorescencia.

Citometra de flujo A, el citmetro de flujo evala parmetros de las clulas individuales a medida que las clulas fluyen a travs de un rayo lser a velocidades de ms de 5.000 por segundo. El tamao y granularidad de las clulas se determinan por la dispersin de la luz (DU, y la expresin del antgeno se evala porinmunofluorescencia (F), utilizando anticuerpos marcados con diferentes sondas fluorescentes. De 8 a O, anlisis de clulas T de un paciente normal. 8, el anlisis de dispersin de la luz se utiliz para definir los linfocitos (Li), los monocitos (Mo) y polimorfonucleares (PMN)[, los linfocitos se analizaron para determinar la expresin de CD3 para identificar clulas T (presentadas en un histograma). O, se identificaron clulas T CD4 y CD8. Cada punto representa una clula T. (Datos comprobados por el doctor Tom Alexander, Akron, Ohio.)

INMUNOANALISIS PARA ANTICUERPOS Y ANTIGENOS SOLOUBLES ENZIMOINMUNOANALISIS DE ABSORCION (ELISA)

La tcnica de enzimoinmunoanlisis de absorcin (ELISA) utiliza un antgeno inmovilizado en una superficie, una bolita o un filtro de plstico para capturar y separar un anticuerpo especfico de otros anticuerpos presentes en el suero de un paciente. El anticuerpo del paciente as fijado se detecta posteriormente por medio de un anticuerpo antihumano con una enzima unida de forma covalente (p. Ej., peroxidasa de rbano picante, fosfatasa alcalina, galactosidasa). Se cuantifica por espectrofotometra segn la intensidad del color producido en respuesta a la conversin de un sustrato adecuado por la enzima. Se puede determinar la concentracin real del anticuerpo por comparacin con soluciones estn dar de anticuerpos. Las diversas variaciones de los ELISA difieren en la forma en la que capturan o detectan los anticuerpos o los antgenos.

Los ELISA tambin se pueden utilizar para cuantificar un antgeno soluble en la muestra de un paciente. En estos anlisis el antgeno soluble es capturado y concentrado por un anticuerpo inmovilizado y despus se detecta con un anticuerpo diferente marcado con una enzima. Un ejemplo de un ELISA que se utiliza comnmente es la prueba domstica de embarazo con la hormona gonadotropina corinica humana.

Enzimoinmunoanlisis para la cuantificacin de anticuerpos o antgenos. A, deteccin de anticuerpos. 1, un antgeno vrico obtenido de clulas infectadas, viriones o ingeniera gentica se fija a la superficie. 2, se agrega suero del paciente y se deja que se una al antgeno. Los anticuerpos no fijados se eliminan con el lavado. 3, se agrega anticuerpo antihumano conjugado con una enzima y se elimina con el lavado el anticuerpo no fijado. 4, se agrega un sustrato y 5, ste se convierte en cromforo, precipitado o luz. B, captura y deteccin del antgeno. 1, se fija a la superficie un anticuerpo antivrico. 2, se agrega una muestra que contiene antgeno y se elimina con el lavado el antgeno no fijado. 3, se agrega un segundo anticuerpo antivrico para detectar el antgeno capturado. 4, un antgeno humano conjugado con una enzima se agrega, se lava y se contina con, 5, un sustrato que es, 6, convertido en cromforo, precipitado o luz.

WESTERN BLOT

El anlisis Westem blot es una variante de un ELISA. En esta tcnica, protenas vricas separadas por electroforesis segn su peso molecular o su carga se transfieren (impregnan blotD a un papel de filtro (p. Ej., nitrocelulosa, nylon)Cuando se exponen al suero del paciente, las protenas inmovilizadas capturan los anticuerpos antivirus especficos y se visualizan con anticuerpos antihumanos conjugados con enzimas. Esta tcnica muestralas protenas reconocidas por el suero del paciente. El anlisis Western blot se utiliza para confirmar los resultados del ELISA 1 en pacientes con sospecha de estar infectados por virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

Western blot. Las protenas se separan por electroforesis con dodecil sulfato sdico en gel de poliacrilamida (DSSGEPA) se electrotransfieren a un papel de nitrocelulosa (NC) y se incuban con antisuero especfico del antgeno o del paciente W Ably despus con suero antihumano conjugado con enzimas (2 Ab) La 1 conversin enzimtica del sustrata identifica al antgena.

RADIOINMUNOANALISIS

En el radioinmunoanlisis (RIA) se utilizan anticuerpos o antgenos marcados radiactivamente (con yodo 125) para cuantificar complejos antgeno-anticuerpo. El RIA se puede efectuar como un anlisis de captura, como se describi anteriormente para el ELISA, o como un anlisis de competencia. En un anlisis de competencia los anticuerpos en el suero de un paciente se cuantifican segn su capacidad de competir con un anticuerpo marcado radiactivamente en el laboratorio y reemplazado en los complejos antgenoanticuerpo. Los complejos antgeno-anticuerpo se precipitan y se separan de los anticuerpos libres y se mide la radiactividad de las dos fracciones. La cantidad de anticuerpos del paciente se cuantifica posteriormente a partir de curvas estn dar preparadas utilizando cantidades conocidas del anticuerpo competidor. El radioalergoanlisis es una variante del RIA de captura en el cual se usan anti IgE marcados radiactivamente para detectar respuestas especficas a un alergeno.

FIJACION DEL COMPLEMENTO

La fijacin del complemento es una prueba serolgica estndar pero tcnicamente difcil. En esta prueba la muestra de suero del paciente se hace reaccionar con antgeno del laboratorio y complemento extra. Los complejos antgeno-anticuerpo se unen, activan y fijan (consumen) el complemento. Despus se analiza el complemento residual por medio de la lisis de hemates recubiertos con anticuerpos. Los anticuerpos medidos con este sistema generalmente se desarrollan algo ms tarde en el curso de una enfermedad que los medidos con otras tcnicas.

NEUTRALIZACION E INHIBICION DE LA HEMAGLUTINACION

En los anlisis de inhibicin de anticuerpos se utiliza la especificidad de un anticuerpo para evitar una infeccin (neutralizacin) y otra actividad (inhibicin de la Hemaglutinacin) para identificar la cepa del agente infectante, usualmente un virus, o para cuantificar las respuestas de anticuerpos a una cepa especfica de un virus. Por ejemplo, la inhibicin de la hemoaglutinacin se utiliza para distinguir diferentes cepas de virus influenza A.

AGLUTINACION CON LATEX

La aglutinacin con ltex es una prueba rpida y tcnicamente simple para detectar un anticuerpo o un antgeno soluble. Los anticuerpos especficos de un virus hacen que las partculas de ltex recubiertas con antgenos vricos se agrupen. Inversamente, las partculas de ltex recubiertas de anticuerpos se utilizan para detectar antgenos vricos solubles. En la hemaglutinacin pasiva se utilizan como indicadores eritrocitos modificados antignicamente en lugar de partculas de ltex.

SEROLOGIA

La respuesta inmune humoral de un paciente proporciona una historia de sus infecciones. La serologa se puede utilizar para identificar el agente infectante, evaluar el curso de una infeccin o determinar la naturaleza de la infeccin: si es una infeccin primaria o una reinfeccin, o si es aguda o crnica. Los datos serolgicos de una infeccin se obtienen del tipo y ttulo de los anticuerpos y de la identidad de los objetivos antignicos. Las pruebas serolgicas se utilizan para identificar virus y otros agentes difciles de aislar y cultivar en el laboratorio o que causan enfermedades con cursos ms lentos.La concentracin relativa de anticuerpos se considera como un ttulo. Un ttulo es el inverso de la mayor dilucin, o menor concentracin (p. Ej., dilucin de 1 :64 = ttulo de 64) del suero de un paciente que conserva actividad en los anlisis antes descritos. Las IgG, IgA, IgE o IgM especficas de un paciente se pueden evaluar separadamente por medio del uso de un segundo anticuerpo antihumano marcado que sea especfico para el iso tipo de anticuerpo por inmunofluorescencia indirecta, aglutinacin con ltex, ELISA o RIA.

La serologa se utiliza para determinar el estado de evolucin de una infeccin, estableciendo si se ha producido seroconversin. La seroconversin ocurre cuando se producen anticuerpos en respuesta a una infeccin primaria. El anticuerpo IgM especfico,

encontrado durante las primeras dos o tres semanas de una infeccin primaria, generalmente indica una infeccin primaria reciente. La seroconversin viene indicada por el hallazgo de un aumento de almeno 4 veces en el ttulo de anticuerpos entre el suero obtenido en la fase aguda de la enfermedad y el obtenido dos o tres semanas ms tarde, durante la fase de convalecencia. Una posterior reinfeccin o recurrencia causa una respuesta anamnstica (secundaria o amplificada). Los ttulos de anticuerpos pueden mantenerse altos, sin embargo, en pacientes cuya infeccin recurre con frecuencia (p. Ej., herpes virus).

La serologa tambin se puede utilizar para determinar el estadio de una infeccin ms lenta o crnica (p.ej., hepatitis B, mononucleosis infecciosa causada por el virus de Epstein Barr) basndose en la presencia de anticuerpos para antgenos especficos. Los primeros anticuerpos que se detectan son los dirigidos contra los antgenos ms accesibles al sistema inmune (p.ej., en el virin, en la superficie de las clulas infectadas, secretados). Ms tarde, en el curso de la infeccin, cuando las clulas han sido lisadas por el virus infectante o por la respuesta inmune celular, se detectan anticuerpos dirigidos contra las protenas intracelulares.

GRACIAS