UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJA CENTRO DE CINCIAS DA SADE CURSO DE FARMCIA

AVALIAO TOXICOLGICA DE NANOPARTCULAS

Prof. Rilton Alves de Freitas
Centro e Cincia da Sade, Universidade do Vale do Itajai, Itajai-S.C., Brasil
Aula curso Second Brazilian School on Nanobiotechnology-Itajai-S.C. 4-10 de Novembro 2007 (rede de nanobiotecnologia-NANOBIOTEC

ASPECTOS GERAIS DE NANOPARTCULAS

Fatores de toxicidade de nanopartculas (Nighswonger, 1999; Oberdrster et al., 2005; Smart et al. 2005)::
- Como citado anteriormente a razo rea superficial pela massa, pois uma grande rea superficial gera partculas com uma maior rea de contato com membranas clulas, assim como uma grande capacidade de absoro e transporte de substncias txicas. - O Tempo de reteno da partcula, pois quanto maior o tempo de contato da mesma com a membrana celular, maior a chance de dano. Este fator incorpora o conceito de mobilidade de partcula, ou pelo clearance ou migrao para tecidos adjacentes. - Reatividade ou toxicidade inerente do composto qumico contido com a partcula.

ASPECTOS GERAIS DE NANOFIBRAS

Tamanho da fibra x respirabilidade (capacidade de penetrar na regio centro-acinar do pulmo).
Fibras com comprimento maior que 15 um apenas so respirveis se apresentam uma espessura menor que 5 um. Fibras longas (>17 um) tornam difcil a fagocitose por macrfagos, promovendo uma resposta crnica que contribui para a fibrose pulmonar. Fibras curtas, menores que 7 um, so por outro lado facilmente fagocidadas, e removidas por macrfagos alveolares (DONALDSON e TRAN, 2004; YE et al., 1999; DONALDSON et al., 1992).

A Biopersistncia: partculas longas so dificilmente fagocitadas por macrfagos.

Fibras biosolveis so capazes de se difundir reduzindo e serem fagocitadas mas facilmente, gerando uma baixa biopersistncia e reduzindo assim a toxicidade de fibras longas longas (maiores que 20 um).

Reatividade ou toxicidade inerente, dependendo basicamente dos componentes qumicos da nanopartculas.

REGULAMENTAO DA NANOTOXICOLOGIA
AVALIAO COMPLETA DO RISCO DE PRODUO DE NANOPARTCULAS (Friedrichs, Schulte, 2007)
Identificao do risco Caracterizao do risco Avaliao do risco Preveno e controle o risco Avaliao das medidas de controle do

Obs:. Royal Society and the Royal Academy of Engineering of UK government, Recommend nanoparticulate materials to be treated as new substances.

Tempo para desenvolver um medicamento

Inveno e desenvolvimento 5.0000 a 10.000 selecionados

Testes pr-clnicos (testes laboratoriais em animais)

Fase I 20 a 80 voluntrios saudveis para determinar segurana e dosagem 250 entram em teste pr-clnico

Fase II 100 a 300 voluntrios para determinar eficcia e efeitos colaterais

Fase III 1.000 a 20.000 pacientes voluntrios para monitorar reaes adversas em uso de longa durao

5 entram em testes clnicos

Aprovao do Governo
Anos Fase IV Teste adicional ps-comercializao

0
Patente

4
Patente

10

12

14

15

Apenas 1 chega ao mercado

solicitada concedida

Avaliao toxicolgica Estudos Pr- clnicos

Estudos Agudos
DL50 Oral DL50 Drmica CL50 Inalatria Irritao / Corroso Ocular Irritao / Corroso Drmica Sensibilizao Cutnea

Avaliao de perigo
Classificao toxicolgica

Avaliao toxicolgica
Estudos sobre mutagenicidade Mutao gnica (procariontes) Mutao cromossmica (eucariontes)
Estudos sobre carcinogenicidade Camundongo (18 meses) Rato (24 meses)

Proibio do Registro

Estudos sobre teratogenicidade Coelho Rato

Avaliao toxicolgica
Estudos de curto prazo Roedor (90 dias) No roedor (1 ano)
Estudos de longo prazo e carcino Camundongo (18 meses) Rato (24 meses)

NOAEL

Estudos de neurotoxicidade Estudos de reproduo e prole

Estudos dos efeitos teratognicos

Definies importantes
Ingesto Diria Aceitvel (IDA) - quantidade mxima que, ingerida diariamente durante toda a vida, parece no oferecer risco aprecivel sade, luz dos conhecimentos atuais

Avaliao toxicolgica

Dose 3X

NOAEL

Dose 2X

Dose X Controle

Avaliao toxicolgica
NOAEL IDA = NOAEL

Fator de incerteza
Fatores de incerteza

TESTES PR-CLNICOS: MTODOS TOXICOLOGICOS IN VITRO

Azul de tripan

QUANTIFICAO DE CRESCIMENTO

MTT (3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)

http://www.ib.amwaw.edu.pl/home/dslado/video/mtt.html

Alaranjado de Acridina
Apoptosis Necrosis

AO stains DNA

Small intense spots

Diffuse spots

Processos necrticos: Lactato desidrogenase

NAD+

NADH

LACTATO

PIRUVATO

QUANTIFICAO APOPTOSE
Processos terminais
Nucleases: Fragmentao do DNA Morfologia (nuclear)

Processos iniciais
Fosfatidilserina Caspases

BROMETO DE ETIDIO

ALARANJADO DE ACRIDINA

DAPI

TUNEL/IODETO PROPIDIO

 Clulas saudveis
Membrana polarizada Sistema de transporte ativo

DAPI
(Azul 460 nm)

Clulas vitais
Membrana polarizada Sem sistema de transporte ativo BROMETO DE ETIDIO (Vermelho 602 nm)

Clulas intactas
Membrana despolarizada Sem sistema de transporte ativo BROMETO DE ETIDIO (Vermelho 602 nm)

Clulas mortas
Membrana despolarizada Sem sistema de transporte ativo BROMETO DE ETIDIO IODETO PROPIDIO (Vermelho 603 nm)

normal early

Annexine-FITC

+ PI

late

Citometria de Fluxo
Espalhamento (Forma, Granulos) size Fluorescence Verde (FITC) Fluorescence Vermelho (PI)

Dados Tpicos
Side scatter Espalhamento lateral Side scatter

Forward scatter Espalhamento frontal

Forward scatter

PI vs. Annexin-FITC)
PI ?
104

Late apoptotic Necrotic

101

FL3-Height 102

103

Viable

Early apoptotic
100 101 102 FL1-Height 103 104

100

Annexine-FITC

Ciclo celular + corantes

Propidium iodide = DNA BRdU = Sintese DNA
M G1 G2
S=DNA synthesis M=cell divides G = gap

Apoptose
Losing DNA

Green

S
Green

S O G1

G1 G2/M

G2/M

Red fluorescence
Lower dilution rate Higher death

Red fluorescence
Higher dilution rate Lower death

CASPASE -3 WESTERN BLOT OU IMMUNOBLOT

FRAGMENTAO DNA

MTODOS DE AVALIAO Clulas Caco-2 DA BIODISPONIBILIDADE IN VITRO DE NANOPARTCULAS

insert culture dish apical medium

Basolateral medium

Caco-2 cell monolayer

Permeao aparente (Papp)

200.000 clulas/mL

Clula Caco-2 Meio E-MEM 10% SFB Baso Lateral Poro apical

Matriz extracelular Incubao 14 28 dias 37oC/5%CO2 Tempos 0 24 horas Intervalo 2h

TEER 350 *cm2

CLASSIFICAO BIOFARMACUTICA
Solubilidade e Permeabilidade so os parmetros chaves que controlam a absoro de frmacos (AMIDON, 1995) Classe I: Frmacos de alta solubilidade e alta permeabilidade; Classe II: Frmacos de baixa solubilidade e alta permeabilidade; Classe III: Frmacos de alta solubilidade e baixa permeabilidade; Classe IV: Frmacos de baixa solubilidade e baixa permeabilidade

Manitol

> 300 cm2

< 300 cm2

TEER: Resistncia Eltrica Transepitelial

Apical

enterocito

Basal

APICAL

* enterocito CYP3A4

BASAL

APICAL

enterocito
*

CYP3A4

BASAL

APICAL

enterocito
*

BASAL

APICAL

Pgp

OAT P
enterocito

CYP3A4

BASAL

BIODISPONIBILIDADE
Conc. Basal tg

TEMPO (h)
Classificao do frmaco segundo o Sistema de Classificao Biofarmacutico. Papp
Classe 1 Altamente solveis e altamente permeveis > 10-5

Razo dose/solubilidade
< ou = 0,5

2 Baixa solubilidade e alta permeabilidade

3 Alta solubilidade e baixa permeabiliade 4 baixa solubilidade e baixa permeabilidade

> 10-5
< 2 x 10-6 < 2 x 10-6

> 0,5
< ou = 0,5 >1

 Papp > 10-6 cm/s: 100% absorvido 10-7 < Papp < 10-6 cm/s: 1 99% absoro Papp < 10-7 cm/s: < 1 % absoro

Bioequivalncia: Alta permeabilidade Papp > 10-5 cm/s Baixa permeabilidade Papp < 10-5 cm/s

TESTES PR-CLNICOS: TESTES TOXICOLGICOS IN VIVO

4. MUTAGNESE (GENOTOXICIDADE) E CARCINOGNESE

Acridinas = intercalantes Levam a mudana de fase de leitura

Dmero de pirimidina Leso mais comum do UV curto (fotoliase)

Nem sempre a droga mutagnica Aflatoxina do fungo do amendoim ativada perto do ncleo

Reparo de erros de pareamento Mismatch repair

Expanso de repeties Huntintina expande de 6-31 rep. para 36-82

Teste de AMES 10 bilhes de Salmonella hisUma reverso de mutao torna-as his+

GENOTOXICIDADE
Lavar com PBS gelado

Remoo das epfises Camundongo Fmur

1) Contagem cmara de Neubauer 2) Viabilidade 85% 3) 1.000.000 cel/mL

Lminas Jateadas Agarose 1% Agarose Low melting 0,75% Incubar 1h 37C/5%CO2 Controles DMSO MMS ou H2O2

Tampo de lise

Tampo de corrida 25 V 300 mA 30 min

Tampo de Neutralizao Brometo de etdeo

DMSO: Ncleo ntegro (controle NEGATIVO de Genotoxicidade) MMS: Fragmentao nuclear (controle POSITIVO de Genotoxicidade)

Mtodo de classificao de Kobayashi et al. (1995); Miyamae et al. (1998) 1)sem cauda 2) cometas com pequenas caudas (caudas com comprimento < 25% da cabea) 3) Cometas com caudas de tamanho mdio (caudas com comprimento entre 25% e 100% da cabea) 4) Cometas com caudas longas (comprimento da cauda > que a cabea) 5) Cometas mal definidos ou com cabea pequena.