EXPRESSO DE PROTENAS EM

BACTRIAS

Joo Fernando Bortoleto

Jeanne Blanco De Molfetta Machado

produo de protenas heterlogas

Uso de uma clula ou um organismo para expressar uma protena produzida em outra clula ou outro organismo.

Ex.: TAQ DNA Polimerase, enzimas de restrio

Para que produzir protenas recombinantes?

Pesquisa em estrutura e funo de protenas Imunizao Frmacos: anticorpos teraputicos, hormnios, fatores de coagulao vacinas,

Fator VIII da imunoglobulina recombinante

Insulina

Interferon

Por que expressar protenas recombinantes?

Dificuldade de se purificar do tecido original Protenas do tecido podem estar contaminadas Protenas recombinantes engenheiradas podem ser

Processo completamente controlado

Especificidade
Quantidade

Como preparar um sistema recombinante.

Isolar e preparar o DNA ou cDNA

Escolher o sistema apropriado

Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado

Checar se a protena foi expressa

Checar se est solvel Purificar Checar se est ativa Caracterizar a protena

CLONAGEM E TRANSFORMAO EM PLASMDEOS

CLIVAGEM ou PCR LIGAO

TRANSFORMAO

Como preparar um sistema recombinante

Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar

Escolher o sistema apropriado

Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado

Checar se a protena foi expressa

Checar se est solvel Purificar Checar se est ativa Caracterizar a protena

Vetores de expresso- componentes bsicos

Promotor

Stio de ligao do ribossomo M13 ORI-

malE
Origem de replicao

Stio de poliadenilao

Terminador

Marcadores seletivos

Caractersticas que devem ser avaliadas em cada sistema de expresso

Taxa de crescimento celular Complexidade do meio de cultura Custo do meio de cultura Nvel de expresso Capacidade de expressar extracelularmente Capacidade de produzir as modificaes ps-traducionais tais como: dobramento correto, formao das pontes dissulfeto, glicosilao, fosforilao, acetilao

Vantagens dos sistemas de expresso eucariticos

- Dobramento das protenas eucariticas mais semelhante. - Adequado para protenas ricas em cistenas- pontes dissulfeto. - Modificaes ps-traducionais. - Pode produzir grandes quantidades de protenas com o uso de equipamentos prprios (fermentadores).

Desvantagens dos sistemas de expresso eucariticos

- Nveis de expresso mais baixos.
- Poucos vetores disponveis

- Sistemas caros
- Necessitam equipamentos adequados

Escolha do sistema - hospedeiros

Bactrias Gram-negativas E. coli e Caulobacter Bactrias Gram-positivas Bacillus subtilis Leveduras Saccharomyces pichiapastoris Fungos filamentosos Aspergillus e Trichoderma Clulas de inseto Clulas de mamfero Clulas vegetais em cultura Ocito de Xenopus Plantas transgnicas e Animais transgnicos

EXPRESSO PROTENA HETERLOGA

Linhagens de E. coli modificadas - Gram negativa

Replicao a cada 20 minutos em condies ideais de

crescimento

Disponibilidades de vrios vetores de clonagem Disponibilidade de vrias cepas mutantes, deficientes em proteases

Como preparar um sistema recombinante

Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar

Escolher o sistema apropriado

Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado

Checar se a protena foi expressa

Checar se est solvel Purificar Checar se est ativa Caracterizar a protena

Eletroporao, biobalistica, vrus, ... X sistema

Como preparar um sistema recombinante

Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar

Escolher o sistema apropriado

Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado

Checar se a protena foi expressa

Checar se est solvel Purificar Checar se est ativa Caracterizar a protena

Seleo Cepa Transformada

Vetores carregam gene resistncia a antibiticos Manuteno Presso Seletiva

Meio + antibitico

Seleo
Antibiticos: ampicilina, canamicina, cloranfenicol, tetraciclina. Gentamicina Higromicina, canamicina Herbicidas: BASTA

Como preparar um sistema recombinante

Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar

Escolher o sistema apropriado

Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado

Checar se a protena foi expressa

Checar se est solvel Purificar Checar se est ativa Caracterizar a protena

Tempo/ solubilidade

Controle da induo

PM

S0 S1 S2

S3

S4 P0

P1 P2 P3 P4

S0 S3 C3

PM

Sistema procaritico Desvantagens

No realiza modificaes ps-traducionais
- No realiza secreo de protenas. Algumas protenas so txicas para as bactrias. Dobramento incorreto de protenas (protenas ricas em cys) -Tendncia a formar corpsculos de incluso. Degradao proteoltica Codon usage (uso de tRNAs)

PROBLEMAS COMUNS da EXPRESSO em E. coli

PROTENA NO EXPRESSA

Alternativa

sequenciar, uso do cdigo

Presena de codons raros na protena de interesse

Codons raros em E.coli AGA, AGG, CGA, CGG,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Arg UGU, UGC..........................................Cys GGA, GGG...........................................Gly AUA.....................................................Ile CUA, CUC............................................Leu CCC, CCU, CCA...................................Pro UCA, AGU, UCG, UCC......................Ser ACA......................................................Thr CDON PLUS, ROSETA

Como preparar um sistema recombinante

Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar

Escolher o sistema apropriado

Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado

Checar se a protena foi expressa

Checar se est solvel Purificar Checar se est ativa Caracterizar a protena

PURIFICAO PROTENA RECOMBINANTE

pGEX Glutationa S-Transferase agarose-glutationa pQE, pET tag de Histidinas coluna de nquel

Clivagem qumica ou enzimtica

Sistemas de Purificao
GST Clivagem com fator Xa Protena de interesse

clonagem

Cromatografia

lavagens

eluio