Anda di halaman 1dari 43

Robertus Wandi I 211 10 020

Tahap

pendahuluan dalam suatu penelitian fitokimia yang bertujuan untuk memberikan gambaran tentang golongan senyawa yang terkandung dalam tanaman yang sedang diteliti. Metode skrining fitokimia dilakukan dengan menggunakan suatu pereaksi warna. Hal penting yang berperan penting dalam skrining fitokimia adalah pemilihan pelarut dan metode ekstraksi (Kristianti dkk., 2008).

Skrining

fitokimia digunakan untuk mendeteksi senyawa tumbuhan berdasarkan golongannya. Sebagai informasi awal dalam mengetahui golongan senyawa kimia apa yang mempunyai aktivitas biologis dari suatu tanaman (Teyler, 1998).

Pemeriksaan

alkaloid Pemeriksaan glikosida Pemeriksaan steroid/triterpenoid Pemeriksaan saponin Pemeriksaan polifenol/tanin Pemeriksaan flavonoid Pemeriksaan kardenolin/bufadienol Pemeriksaan antrakuinon

Prosedur

uji dengan KLT dilakukan untuk lebih menegaskan hasil yang didapat dari skrining fitokimia, karena berfungsi sebagai penegasan; maka uji KLT hanya dilakukan untuk golongan-golongan senyawa yang menunjukkan hasil positif pada skrining fitokimia (Marliana, dkk., 2005).

Larutan ekstrak uji sebanyak 2 mL diuapkan di atas cawan porselin hingga di dapat residu. Residu kemudian dilarutkan dengan 5 mL HCl 2N. Larutan yang didapat kemudian dibagi ke dalam 4 tabung reaksi. Tabung 1 ditambahkan dengan HCl 2N yang berfungsi sebagai blanko. Tabung 2 ditambahkan pereaksi Dragendorff sebanyak 3 tetes. Tabung 3 ditambahkan pereaksi Mayer sebanyak 3 tetes Tabung 4 ditambahkan amonia 25% hingga pH 8-9. kemudian ditambahkan kloroform, dan diuapkan diatas water bath. Selanjutnya ditambahkan HCl 2N, diaduk dan disaring. Kemudian ditambahkan pereaksi Wagner sebanyak 3 tetes(Jones and Kinghorn, 2006)

Filtrat

pada skrining fitokimia ditambah amonia 25% hingga pH 8-9. kemudian ditambahkan kloroform, dan dipekatkan diatas waterbath. Fase kloroform ditotolkan pada plat silika gel G. elusi dilakukan dengan metanol:NHOH pekat = 200:3. Plat dikeringkan dan diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm dan 366 nm. Kemudian plat disemprot dengan pereaksi Dragendorff, dikeringkan dan diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm dan 366 nm (Marliana, dkk., 2005).

Alkaloid mengandung N sebagai bagian dari sistem sikliknya serta mengandung substituen yang bervariasi seperti gugus amina, amida, fenol dan metoksi sehingga alkaloid bersifat semipolar (Purba, 2001). Tujuan penambahan HCl karena alkaloid bersifat basa sehingga biasanya diekstrak dengan pelarut yang mengandung asam (Harborne, 1996). Hasil positif alkaloid pada uji Mayer ditandai dengan endapan putih. Diperkirakan endapan tersebut adalah kompleks kaliumalkaloidn(Marliana, dkk., 2005). Pada pembuatan pereaksi Mayer, larutan merkuri (II) klorida ditambah kalium iodida akan membentuk endapan merkurium (II) iodida. Jika kalium iodida yang ditambahkan berlebih maka akan terbentuk kalium tetraiodomerkurat (II) (Svehla, 1990). Pada uji alkaloid dengan pereaksi Mayer, diperkirakan N pada alkaloid akan bereaksi dengan K dari Kalium Tetraiodomerkurat (II) membentuk kompleks Kalium-Alkaloid yang mengendap (Marliana dkk., 2005; Sangi dkk., 2008).

Hasil

positif Dragendorff ditandai dengan terbentuknya endapan coklat muda sampai kuning. Endapan tersebut adalah KaliumAlkaloid. Pada pembuatan pereaksi Dragendorff, bismut nitrat dilakukan dalam HCl agar tidak terjadi reaksi hidrolisis karena garam-garam bismut mudah terhidrolisis membentuk ion bismutil (BiO) (Marliana, dkk., 2005)

ion Bi tetap berada dalam larutan, maka larutan itu ditambah asam sehingga kesetimbangan akan bergeser ke arah kiri. Selanjutnya ion Bi dari bismut nitrat bereaksi dengan kalium iodida membentuk endapan coklat/hitam Bismut(III) iodida yang kemudian melarut dalam kalium iodida berlebih membentuk kalium tetraiodobismutat (Svehla, 1990). Pada uji alkaloid dengan pereaksi Dragendorff, N digunakan untuk membentuk ikatan kovalen koordinat dengan K yang merupakan ion logam (Miroslav, 1971).
Agar

Hasil

positif alkaloid pada uji Wagner ditandai dengan terbentuknya endapan cokelat muda sampai kuning. Diperkirakan endapan tersebut adalah kalium-alkaloid. Pada pembuatan pereaksi Wagner, iodin bereaksi dengan ion I dari kalium iodida menghasilkan ion I yang berwarna cokelat. Pada uji Wagner, ion logam K akan membentuk ikatan kovalen koordinat dengan nitrogen pada alkaloid membentuk kompleks kalium-alkaloid yang mengendap (Marliana, dkk., 2005).

Pelarut

pengembang yang digunakan pada KLT untuk alkaloid adalah etil asetat:metanol:air (100:16,5:13,5) (Marliana, dkk., 2005). Setelah plat disemprot dengan pereaksi Dragendorrf akan menunjukkan bercak coklat jingga barlatar belakang kuning (Harbone, 1996). Timbulnya noda dengan Rf 0,9 berwarna kuning muda pada pengamatan sinar tampak, berwarna kuning pada UV 254 nm dan berwarna hijau muda pada UV 366 nm menegaskan adanya kandungan alkaloid pada ekstrak (Marliana, dkk., 2005).

Pemeriksaan

glikosida dilakukan dengan reaksi Liebermann-Burchard. Serbuk simplisia uji dilarutkan dalam pelarut etanol, diuapkan diatas penangas air, larutkan sisanya dalam 5 mL asam asetat anhidrat P. Ditambahkan 10 tetes as sulfat P (Depkes RI, 1989)

Glikosida

merupakan senyawa yang mengandung komponen gula dan non gula sehingga dapat tertarik pada pelarut etanol (Harbone, 1987) Pemeriksaan glikosida akan positif apabila ditambahkan asam sulfat P akan memberikan warna biru atau hijau (Depkes RI, 1989)

Larutan

uji sebanyak 2 mL diuapkan. Residu yang diperoleh dilarutkan dalam 0,5 mL kloroform lalu ditambahkan dengan 0,5 mL as asetat anhidrat. Selanjutnya, campuran ini ditetesi dengan 2 mL as sulfat pekat melalui dinding tabung tersebut (Jones and Kinghorn, 2006; Evans, 2009).

Senyawa triterpenoid adayang memiliki struktur siklik berupa alkohol yang menyebabkan senyawa ini cenderung bersifat semipolar (Titis, dkk., 2013). Pengujian steroid/triterpenoid didasarkan pada kemampuan senyawa untuk membentuk warna dengan HSO pekat dalam pelarut as asetat anhidrat (Sangi dkk., 2008). Hasil positif adanya kandungan senyawa triterpenoid terbentuknya cincin berwarna kecoklatan atau violet (Sangi dkk., 2008). Hasil positif adanya kandungan senyawa steroid terbentuknya warna hijau kebiruan (Jones and Kinghorn, 2006; Evans, 2009).

Ekstrak diuji dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 mL air panas, dinginkan dan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Terbentuk buih yang mantap selama tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm. pada penambahan HCl 2N, buih tidak hilang (Depkes RI, 1995) Uji penegasan dilakukan dengan menguapkan sampel sampai kering kemudian mencucinya dengan heksana sampai filtrat jernih. Residu yang tertinggal ditambahkan kloroform, diaduk 5 menit, kemudian ditambahkan NaSO pekat dan diaduk kembali (Marliana, dkk., 2005).

Sampel

ditambah dengan HCl 2M, diaduk, direfluks 6 jam diatas waterbath, kemudian didinginkan. Setelah itu dinetralkan dengan amonia, diuapkan diatas waterbath, ditambah 5 tetes kloroform, dan ditotolkan pada plat silika gel G. Elusi dilakukan dengan kloroform:aseton = 4:1. plat dikeringkan dan diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm dan 366 nm. Kemudian plat disemprotkan dengan SbCl dioven pada suhu 110C selama 10 menit, dan diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm dan 366 nm (Marliana, dkk., 2005).

Saponin merupakan glikosida triterpen yang memiliki sifat cenderung polar karena ikatan glikosidanya (Harbone, 1996). Saponin merupakan senyawa yang mempunyai gugus hidrofilik dan hidrofob. Pada saat digojok gugus hidrofil akan berikatan dengan air sedangkan gugus hidrofob akan berikatan dengan udara sehingga membentuk buih. Kemudian dilakukan penambahan HCl 2N yang bertujuan untuk manambah kepolaran sehingga gugus hidrofil akan berikatan lebih stabil dan buih yang terbentuk menjadi stabil (Kumalasari dan Sulistyani, 2011). Timbulnya busa menunjukkan adanya glikosida yang mempunyai kemampuan membentuk buih dalam air yang terhidrolisis menjadi glukosa dan senyawa lainnya (Rusdi, 1990). Pada uji penegasan saponin akan terbentuknya cincin merah sampai coklat (Marliana, dkk., 2005).

Salah

satu pelarut pengembang yang biasa digunakan untuk uji KLT saponin adalh heksana:aseton (4:1). Setelah penyemprotan dengan SbCl dalam as asetat, saponin terdeteksi sebagai noda berwarna merah jambu sampai ungu (Santos et al, 1978) Timbulnya noda dengan Rf 0,84 dan 0,79 yang berwarna merah jambu pada pengamatan dengan sinar tampak dan berwarna kuning pada UV 366 nm menegaskan adanya kandungan saponin pada ekstrak (Marliana, dkk., 2005)

Larutan

ekstrak uji sebanyak 1 mL direaksikan dengan larutan besi (III) klorida 10% (Robinson, 1991; Jones and Kinghorn, 2006) Uji KLT pada tanin dan polifenol tidak dilakukan karena tidak ditemukan prosedur yang tepat (Marliana, dkk., 2005).

Golongan

tanin yang merupakan senyawa fenolik yang cenderung larut dalam air sehingga cenderung bersifat polar (Harbone, 1987). Pengujian tanin dilakukan dengan penambahan FeCl. Perubahan warna ini terjadi ketika penambahan FeCl yang bereaksi dengan salah satu gugus hidroksil yang ada pada senyawa tanin. Pada penambahan FeCl pada ekstrak uji menghasilkan warna hijau kehitaman yang menunjukan mengandung senyawa tanin terkondensasi (Sangi dkk., 2008).

Sebanyak 3 mL sampel diuapkan, dicuci dengan heksana sampai jernih. Residu dilarutkan dalam 20 mL etanol kemudian disaring. Filtrat dibagi 4 bagian A, B, C dan D Filtrat A sebagai blangko Filtrat B ditambahkan 0,5 mL HCl pekat kemudian dipanaskan pada penangas air, jika terjadi perubahan warna merah tua sampai ungu menunjukkan hasil yang positif (metode Bate SmithMetchalf). Filtrat C ditambahkan 0,5 mL HCl dan logam Mg kemudian diamati perubahan warna yang terjadi (metode Wilstater sianidin). Warna merah sampai jingga diberikan oleh senyawa flavon, warna merah tua diberikan oleh flavonol atau flavonon, warna hijau sampai biru diberikan oleh aglikon atau glikosida. Filtrat D digunakan untuk uji KLT (Marliana, dkk., 2005).

Filtrat

D pada skrining fitokimia ditotolkan pada plat silika gel G. Dielusi dengan butanol : asam asetat : air = 3:1:1, kemudian dikeringkan dan diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm dan 366 nm. Selanjutnya plat disemprot dengan amonia, dikeringkan dan diamati kembali pada cahaya tampak, UV 254 nm dan 366 nm

Flavonoid memiliki ikatan dengan gugus gula yang menyebabkan flavonoid bersifat polar (Markham, 1988). Uji Wilstater sianidin biasa digunakan untuk mendeteksi senyawa yang mempunyai inti benzopiron. Warna merah tua sampai ungu yang terbentuk pada uji Bate Smith-Mertcalf dan warna merah sampai jingga diberikan oleh senyawa flavon, warna merah tua diberikan oleh flavonol atau flavonon pada uji Wilstater sianidin disebabkan karena terbentuknya garam flavilium (Achmad, 1986).

Pelarut pengembang yang digunakan paada uji KLT flavonoid adalah butanol:as asetat:air (3:1:1). Setelah disemprot dengan amonia, timbul noda dengan Rf 0,92 dan 0,54 yang berwarna kuning muda setelah disemprot dengan amonia pada pengamatan sinar tampak dan berwarna biru pada UV 366 nm menegaskan adanya kandungan flavonoid (Marliana, dkk., 2005). Flavonoid merupakan senyawa yang memiliki gugus hidroksi berkedudukan orto, sehingga memberikan fluoresensi kuning intensif pada UV 366 nm (Sjahid, 2008).

Uji

ini menggunakan 3 metode yaitu metode Keller Klliani, metode Leiberman-Burchard dan metode Kedde (Marliana, dkk., 2005): Metode Keller-Killiani yaitu dengan menguapkan 2 mL sampel, dan mencucinya dengan heksana sampai heksana jernih. Residu yang tertinggal dipanaskan diatas penangas air kemudian ditambahkan 3 mL pereaksi FeCl dan 1 mL HSO pekat.

Metode

Lieberman-Burchard yaitu dengan cara menguapkan sampel sampai kering. Kemudian ditambahkan kedalamnya 10 mL heksana, diaduk selama beberapa menit lalu biarkan. Selanjutnya diuapkan diatas penangas air dan ditambahkan 0,1 g NaS0 anhidrat lalu diaduk. Larutan disaring sehingga diperoleh filtrat. Kemudian filtrat dipisahkan menjadi 2 bagian, A dan B. Filtrat A sebagai blangko dan filtrat B ditambahkan 3 tetes pereaksi asam asetat glasial dan HSO.

Metode

Kedde yaitu dengan cara menguapkan sampel sampai kering kemudian menambahkan 2 mL kloroform, lalu dikocok dan disaring. Filtrat dibagi menjadi 2 bagian, A dan B. Filtrat A sebagai blangko, dan filtrat B ditambah 4 tetes reagen Kedde. Senyawa kardenolin dan bufadienol akan menunjukkan warna ungu

Sampel

ditotolkan pada plat silika gel G. Dielusi menggunakan CHCl:MeOH = 1:1. plat dikeringkan dan diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm dan UV 366 nm. Selanjutnya disemprotkan dengan pereaksi Kedde, dikeringkan diudara, dan diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm dan UV 366 nm. Selanjutnya plat disemprot dengan amonia, dikeringkan dan diamati kembali pada cahaya tampak, UV 254 nm dan UV 366 nm (Marliana, dkk., 2005).

Hasil

positif pada uji Keller Klilliani menunjukkan adanya deoksi gula untuk glikosida. Terbentuknya cincin merah bata dan berubah menjadi biru atau ungu kemungkinan disebabkan senyawa kompleks. Atom oksigen yang mempunyai pasangan elektron bebas pada gugus gula bisa mendonorkan elektronnya pada Fe membentuk kompleks (Santos et al., 1978).

Adanya

kardenolin/bufadienol dapat dilakukan uji Lieberman-Burchard yang merupakan uji karakteristik untuk sterol tidak jenuh dan triterpen. Hasil positif pada uji ini ditandai dengan terbentuknya cincin hijau yang berasal dari reaksi antara sterol tidak jenuh atau triterpen dengan asam (CHCOOH dan HSO) (Santos elal., 1978).

Uji

Kedde dilakukan untuk menunjukkan adanya lakton tak jenuh. Hasil positif pada uji ini diperkirakan adanya kardenolin/bufadienol dengan 3,5 dinitrobenzen (pereaksi Kedde) yang ditandai dengan warna cincin ungu (Santos et al., 1978).

Pelarut

pengembang yang digunakan pada KLT untuk kardenolin/bufadienol adalh CHCl:metanol (1:1). Setelah penyemprotan dengan pereaksi Kedde, noda biru violet mengindikasikan adanya lakton tak jenuh yang terdapat pada kardenolin/bufadienol (Harborne, 1996). Timbulnya noda dengan Rf 0,41 yang berwarna kuning kemerahan pada pengamatan dengan sinar tampak dan berwarna biru pada UV 366 nm menegaskan adanya kandungan kardenolin/bufadienol (Marliana, dkk., 2005).

Dilakukan

dengan uji Brontrager Melarutkan 2 mL sampel dengan 10 mL akuades kemudian disaring, filtrat diekstrak dibagi menjadi 2 bagian, A dan B. Filtrat A digunakan sebagai blangko dan filtrat B ditambahkan 5 mL amonia kemudian dikocok (Marliana, dkk., 2005).

Uji

Brontrager bisa mendeteksi antrakuinon. Antrakuinon akan memberikan karakteristik warna merah, violet, hijau atau ungu dengan basa (Marliana, dkk., 2005).