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BIOTECNOLOGA

Unidad 2 Microbiologa industrial


Agosto-Diciembre 2012

UNIDAD 2
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
1. Diseo y optimizacin de medios de cultivo 2. Cultivos mixtos 3. Fermentacin en fase slida 4. Gentica aplicada

Microorganismos industriales Especialistas metablicos


Bacterias, Hongos y Levaduras Caractersticas deseables

Producir la sustancia de inters. Crecimiento rpido. Produccin del metabolito en menor tiempo. No peligroso para humanos, plantas o animales. Libre de toxinas (o fciles de inactivar). Recuperacin simple. Susceptibilidad a manipulacin gentica.

Diseo y optimizacin de medios de cultivo


MEDIO DE CULTIVO

Fuente de carbono y energa

Fuente de fsforo, azufre y oligoelementos

Fuente de Nitrgeno .

Composicin elemental de bacterias y levaduras


% Peso seco Elemento C N P S Levaduras 47 7.5 1.5 1.0 Bacterias 53 12 3 1

O
Mg H

30
0.5 6.5

20
0.5 7

Ceniza

Composicin de microorganismos en molculas principales Molcula Bacterias Protena 55

% Peso seco
Levaduras 40 Mohos 32

Carbohidrat os
Lpidos cido nucleico

9
7 23

38
8 8

49
8 5

Ceniza

Rendimiento YX/S = f(fuente de carbono)


Fuente de carbono y energa Glucosa Metanol Etanol Metano n-alcanos Celulosa Almidn Masa clulas/masa sustrato 0.5 0.5 0.75 0.62 1 0.5 0.5

Urea (inestable)
De De De De De soya semilla de algodn semilla de nabo maz pescado

Harinas

Fuentes de N

Licor de maz

(subproducto del proceso del almidn de maz)

Sales de amonio
Sales de nitrato

Protenas hidrolizadas

Lactosa (suero de leche) Maltosa (en la Industria Cervecera) Almidn gelificado (papas, trigo, avena, maz, etc.) Dextrina (se obtiene del almidn con la -amilasa)

Inulina

Fuentes de C

Celulosa (agua residual industria papelera) Metanol (para producir protena unicelular) Etanol (para producir vinagre y protena unicelular) Glicerol (produccin de esteroides y antibiticos) cidos carboxlicos (actico) Grasas

Hidrocarburos (metano, n-butano, n-pentano)

Se pueden suministar como sales


Otros elementos

Na2HPO4 KH2PO4 Sulfato de sodio

Agua de grifo

Factores para la optimizacin del cultivo

Medio de Cultivo Composicin del medio de cultivo

Microorganismo Seleccin del microorganis mo apropiado

Condiciones ambientales HR, T, pH, Luz

Cultivo axnico o puro


Es un cultivo microbiano que contiene una sola especie de microorganismo.

Diluciones y siembra en agar

El aislamiento de una sola especie se obtiene por

Siembra por estra o rayado

Cultivo mixto
Un cultivo microbiano mixto, est conformado por dos o mas especies diferentes y adems identificadas de microorganismos. Es decir, se tiene ms de una especie de manera intencional y controlada con un propsito.

Ventajas de los cultivos mixtos sobre los cultivos puros


1. 2. 3. Poseen una alta tasa de crecimiento y un rendimiento mas elevado. Son muy resistentes a la contaminacin. Pueden intervenir en las transformaciones en varias etapas de mezclas de sustratos.

Cultivos mixtos
Azcar
Levadura Alcohol Bacteria Ac. actico

Cultivos mixtos en quimiostato


Primer caso: con el mismo sustrato limitante de crecimiento. a) Velocidad especfica de crecimiento coincidente. b) Inhibicin del organismo con mayor. c) Producto del organismo con mayor est presente en el crecimiento del m.o. con menor.

Segundo caso: con diferente sustrato limitante de crecimiento.


a) Los diferentes sustratos estn presentes asimultneamente. b) El producto de un microorganismo es el sustrato de otro microorganismo.

Fermentacin en fase slida


Fermentacin: conversin biolgica anaerbica de las molculas orgnicas, generalmente carbohidratos, en alcohol, cido lctico y gases, mediante la accin de ciertos enzimas que actan directamente o como componentes de ciertas bacterias y levaduras.

Cultivo de microorganismos en medios que contienen o no una cantidad limitada de agua libre.

Fermentacin en fase slida (usos)

Obtencin de enzimas fngicos

Cultivo en superficie

Cultivo de champin

Actividad de agua

Se inhibe el crecimiento bacteriano

aw
An hay crecimiento de hongos

La transferencia de O2 y la eliminacin de CO2 deben ser eficaces.


Aspectos a cuidar en el diseo de una fermentacin en fase slida.

La eliminacin de calor excesivo debe ser eficaz. El tamao de partcula debe ser apropiado para favorecer los puntos anteriores.

Mayor productividad.

Simplicidad de la tcnica.

Ventajas de la fermentacin en fase slida

Menores costos de inversin.

Menor consumo energtico.


Menor volumen de residuales producidas. aguas

No hay generacin de espuma.

Tarea (Entregar mircoles 19 de septiembre)


Se desean producir 30g/L de levadura comestible a partir de glucosa como fuente de carbono y energa, cloruro de amonio como fuente de nitrgeno, fosfato bibsico de sodio y fosfato monobsico de potasio como fuentes de fsforo, y sulfato de sodio como fuente de azufre. Los oligoelementos que se requieren para el crecimiento del microorganismo se considera que estn incluidos en el agua potable utilizada para preparar el medio de cultivo. Tomando como base la composicin qumica promedio de la clula de levadura. Calcular la composicin del medio de cultivo. Recuerde que el crecimiento ptimo de las levaduras se da a un pH entre 4 y 4.5 Considere que la levadura contiene un 85% de agua en su composicin cuando est fresca.

Segunda tanda de exposiciones


Da mircoles 19 de Septiembre Equipo 1 Miranda Marn Mariana

Da 19 de Septiembre Equipo 2 Hurtado Snchez Cristian

Da 19 de Septiembre Equipo 3 Jordi Baquero

Da 19 de Septiembre Equipo 4 Maximino Corts

Gentica aplicada

Organismos transgnicos
Un transgn es un gen de un organismo que se ha insertado en otro organismo distinto. Un organismo transgnico es aquel que contiene un transgn. Tambin se les llama organismos genticamente modificados (GMO)

Productos de la ingeniera gentica


Antes, las personas que padecan diabetes dependan de la insulina extrada de animales para controlar sus niveles de glucosa en sangre. Pero haba un pequeo porcentaje de pacientes que presentaban reacciones inmunolgicas a la versin fornea (porcina o bovina) de insulina.

Otros productos de la biotecnologa

Los microorganismos, plantas y animales pueden alterarse genticamente o manipularse con determinados propsitos.

Los barrenadores del tallo (Diatraea saccharalis y Ostrinia nubilalis) son insectos que constituyen la principal plaga del cultivo de maz en muchos pases productores, tales como la Argentina y Estados Unidos de Norteamrica.

Sus larvas se alimentan de los tallos y las hojas, dejando galeras que daan la planta, la quiebran, impiden el transporte de nutrientes y sustancias y son va de entrada para hongos, cuyas toxinas (micotoxinas) son muy peligrosas para la salud humana.

El maz Bt es un maz transgnico o genticamente modificado que produce en sus flores protenas Cry. As, cuando las larvas de los insectos comnmente denominados "barrenadores del tallo" intentan alimentarse de la hoja o del tallo del maz Bt, mueren.

La denominacin "Bt" deriva de Bacillus thuringiensis, una bacteria que normalmente habita el suelo y cuyas esporas contienen protenas txicas para ciertos insectos. Estas protenas, denominadas "Cry", se activan en el sistema digestivo del insecto y se adhieren a su epitelio intestinal, alterando el equilibrio osmtico del intestino. Esto provoca la parlisis del sistema digestivo del insecto el cual deja de alimentarse y muere a los pocos das. Las toxinas Cry son consideradas inocuas para mamferos, pjaros e insectos no-blanco.

TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE


La tecnologa del ADN recombinante es un conjunto de procedimientos para extraer ADN de una clula, manipularlo in vitro e introducirlo en otra clula generalmente de especie diferente.

Podemos generalizar los pasos de la ingeniera gentica de la siguiente manera:


1) Identificar un carcter deseable en el organismo de origen.

2) Encontrar el gen responsable del carcter deseado (gen de inters). 3) Combinar dicho gen con otros elementos necesarios (vector) para que ste sea funcional en el organismo receptor.

4) Transferir el gen de inters, previamente introducido en el vector adecuado, al organismo receptor. 5) Crecer y reproducir el modificado genticamente. organismo receptor, ahora

Produccin y secuenciacin del ADN (conocer genes), genoma, diagnstico temprano, etc. Permite la produccin de inters y enzimas industriales. Aplicaciones de la tecnologa del ADN recombinante protenas de

La reaccin en cadena de polimerasa (PCR) permite localizar un nico gen a partir de una mezcla y multiplicarlo. (se aplica en criminalstica para comparar sangre, cabello o esperma y en antropologa para analizar genes de momias) Permite manipular (alterar genticamente los microorganismos, las plantas y los animales. Por ejemplo, las plantas pueden ser manipuladas genticamente para producir mejores cosechas o para resistir las enfermedades o los daos causados por los insectos.

Enzimas de restriccin y modificacin


Las enzimas de restriccin reconocen y cortan secuencias de bases especficas de ADN, aunque estn muy extendidas entre los procariotas, son muy raras en eucariotas. In vivo las enzimas de restriccin protegen a los procariotas de ADN hostil extrao, como los genomas vricos.
Las enzimas de restriccin tambin son necesarias para la manipulacin in vitro del ADN y su descubrimiento dio lugar al nacimiento de la ingeniera gentica.

Mecanismo de accin de las enzimas de restriccin


Las endonucleasas de restriccin se dividen en tres grandes grupos. Las de tipo I y III se unen al ADN en secuencias de reconocimiento pero cortan al ADN a una distancia considerable de stas. Las de tipo II cortan el ADN en el interior de las secuencias de reconocimiento, lo que las hace mucho ms tiles para la manipulacin especfica del ADN.

a) Secuencia de ADN reconocida por la endonucleasa EcoRI, las flechas rojas indican los enlaces que cortan las enzimas. La lnea punteada indica el eje de simetra de la secuencia.

b) La misma secuencia tras ser modificada por la metilasa-EcoRI. Se muestran los grupos metilo aadidos por la enzima, que protegen el sitio de restriccin del corte por EcoRI.

Separacin de las molculas de ADN Las enzimas cortan el ADN en segmentos que varan de longitud entre varios cientos y varios miles de pares bases. Una vez cortado el ADN, los fragmentos generados pueden separarse por electroforesis en gel y analizarse.

Electroforesis La electroforesis es una tcnica que separa las molculas cargadas que migran en un campo elctrico. La velocidad de migracin est determinada por la carga de la molcula y por y por su tamao y forma.

En la electroforesis en gel las molculas se separan en un gel poroso y no en una solucin. Los geles hechos de agarosa se utilizan para separar fragmentos de ADN. Cuando se aplica una corriente elctrica los cidos nucleicos se mueven por el gel hacia el electrodo positivo a causa de sus grupos fosfato cargados negativamente.

La presencia de la malla que forma el gel dificulta el progreso que tiene el ADN, y las molculas pequeas o compactas migran ms rpidamente que las grandes. Transcurrido un tiempo el gel se puede teir con un compuesto que se una al ADN, como el bromuro de etidio y el ADN emitir fluorescencia de color naranja bajo luz ultravioleta. Los fragmentos de ADN se pueden purificar y utilizarse con objetivos variados.

Cuantificacin de ADN
Cuando se trabaja con ADN es importante cuantificar la cantidad con la que se dispone. La cuantificacin del ADN se puede llevar a cabo por estimacin de la intensidad de una banda en geles de agarosa en el que el ADN es teido por algn colorante como Bromuro de Etidio, Syber Green o Gel Red, o bien mediante tcnicas de espectrofotometra de luz ultravioleta.

Amplificacin del ADN: Reaccin en cadena de la polimerasa Las copias de secuencias de ADN son necesarias para muchas tcnicas moleculares y la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es el proceso por el que se sintetizan dichas copias in vitro.

La PCR puede copiar segmentos de ADN hasta mil millones de veces en un tubo de ensayo que generan grandes cantidades de genes especficos u otros segmentos de ADN para toda una serie de aplicaciones en biologa molecular.

Pasos de la PCR 1. Se sintetizan dos oligonucletidos cebadores flanqueando el ADN diana en un sintetizador de oligonucletidos y se aaden en exceso a un ADN molde desnaturalizado por calor. 2. A medida que se enfra la mezcla, los cebadores, los cebadores en exceso respecto al molde de ADN aseguran que la mayora de cadenas de molde se aparean con un cebador y no entre si.

3. La ADN-polimerasa extiende los cebadores utilizando el ADN original como molde. 4. Tras un periodo de incubacin, la mezcla se calienta de nuevo para separar las cadenas. Despus la mezcla se enfra para permitir la hibridacin de los cebadores con las regiones complementarias del ADN recin sintetizado y se repite todo el proceso.

Plsmidos
Los plsmidos son molculas de ADN extracromosmico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosmico. Estn presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su tamao vara desde 1 a 250 kb. El nmero de plsmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por clula.

Las molculas de ADN plasmdico, adoptan una conformacin tipo doble hlice al igual que el ADN de los cromosomas, aunque, por definicin, se encuentran fuera de los mismos. A diferencia del ADN cromosomal, los plsmidos no tienen protenas asociadas.

Caractersticas de los plsmidos como vectores de clonacin


Los plsmidos independientemente del hospedador. se replican cromosoma del

Son vectores naturales porque a menudo contienen otros genes que confieren importantes propiedades a sus hospedadores. Tienen un tamao muy pequeo que permite que su ADN sea aislado y manipulado con facilidad.

Tienen un gran nmero de copias, lo que genera una gran cantidad de ADN. Cuentan con la presencia de genes de resistencia a antibiticos, lo que hace la deteccin y la seleccin de los clones surgidos de los plsmidos ms fcil.