BIOTECNOLOGA II LIBRERAS GENMICAS Profesora Alba Ricardo PhD Microbiologa

MTODOS PARA AISLAR EL GEN/DNA DE INTERS 1. LIBRERAS GENMICAS 2.LIBRERAS DE cDNA 3.SNTESIS QUMICA 4.TRANSPOSN TAGGING 5.MAPEO BASADO EN CLONAMIENTO 6.PCR

1. LIBRERAS GENMICAS
Qu es el genoma? El genoma representa el DNA total presente en la clula.

Qu es una librera genmica? Una biblioteca genmica se compone de fragmentos de ADN clonados que representan la totalidad del genoma de un organismo o se puede decir que es una coleccin de clones recombinantes que representan el ADN genmico total de un organismo.

1. LIBRERAS GENMICAS
Qu es el genoma? El genoma representa el DNA total presente en la clula.

Qu es una librera genmica? Las bibliotecas genmicas se utilizan comnmente para el aislamiento de genes cuando la informacin sobre el producto del gen no es conocida o si queremos estudiar las secuencias reguladoras del gen.

Cmo se prepara biblioteca genmica?

Mltiples copias de ADN genmico son digeridos por una enzima de restriccin por un tiempo limitado de manera que slo algunos de los sitios de restriccin en cada molcula se cortan.

Diferentes molculas de ADN se cortan en diferentes lugares, que proporciona un conjunto de fragmentos superpuestos

Para la construccin de una biblioteca genmica, se asla el ADN total de la clula. Dado que la molcula de ADN en todas las clulas es la misma , las bibliotecas genmicas se pueden preparar a partir de cualquier clula de un individuo.

Cmo se prepara biblioteca genmica?

Los genes aislados a partir de bibliotecas genmicas (caso eucariotes) contienen secuencias codificantes (exones), as como (intrones) secuencias no codificantes. El ADN se corta en pequeos trozos con una enzima de restriccin, como Sau3A o Mbo I, para obtener fragmentos de ADN de aproximadamente 20 kb de tamao que se solapen.

Cmo se prepara una biblioteca genmica?

3. Cada fragmento se uni a un vector de clonacin

Cada pieza de ADN se une entonces a un vehculo o vector de clonacin. Los vectores derivados del fago se utilizan comnmente para la Y se transfiere a una clula bacteriana, preparacin de bibliotecas genmicas. El ADN recombinante se La produccin de un introduce luego en conjunto de clones que contienen fragmentos clulas bacterianas genmicos de solapamiento, algunos de los cuales pueden tales como E. coli.
incluir segmentos de gen de inters.

Cmo se prepara una biblioteca genmica?

Las bacterias se siembran en placas de agar que contienen un medio adecuado en el que crecen y forman colonias o placas (cuando el vector es un fago). Cada colonia / placa representa un clon recombinante que lleva una pieza diferente de ADN genmico

Conclusin: Algunos clones contienen todo el gen de inters, otros incluyen parte del gen, y la mayora contienen ninguno de el gen de inters.

Cmo se prepara una biblioteca genmica?

Una coleccin de todos estos clones se denomina una biblioteca genmica. Para aislar los genes de la biblioteca genmica se tamiza con la ayuda de sondas.

Cmo se prepara una biblioteca genmica?

Las bibliotecas genmicas son tiles para estudiar las estructuras detalladas de los genes, para identificar regiones reguladoras, es decir, secuencias de ADN necesarias para la correcta expresin del gen.

Cmo se prepara una biblioteca genmica?

Cuntos clones de la biblioteca genmica deben ser examinados?

Esto depende del tamao de los fragmentos de ADN clonados y el tamao del genoma del organismo cuya biblioteca genmica se construye. El nmero de clones que se proyectarn est dada por la siguiente frmula:

Donde N representa el nmero de clones que se examinarn, p es la probabilidad de encontrar un clon, ln representa el logaritmo natural, f es el tamao del fragmento de ADN clonado y n es el tamao del genoma.

LIBRERAS GENMICAS

2. LIBRERAS DE cDNA
Qu es una biblioteca de cDNA? Es una coleccin de clones recombinantes que representan el ARNm total de una clula o tejido en particular, en alguna etapa de desarrollo. La ventaja de la biblioteca de cDNA es que contiene slo la regin de codificacin de un genoma. Es el mtodo de eleccin para la clonacin de los genes eucariotas en las bacterias ya que stas carecen de mecanismo de splicing.

2. LIBRERAS DE cDNA

2. LIBRERAS DE cDNA

Pasos para la preparacin de la biblioteca de cDNA 1. Aislamiento de ARNm: El

ARNm total se aisl a partir de la clula / tejido de inters (que expresa el gen deseado). Debido a que los ARNm eucariotas contienen una cola de poli A en el extremo 3 ', pueden ser fcilmente separados de los otros tipos de ARN (ribosmico y ARN de transferencia). 2. Preparacin de la hebra sencilla (ss) cDNA: la enzima transcriptasa reversa se utiliza para sintetizar una cadena de ADN complementaria a cada molcula de ARNm

Pasos para la preparacin de la biblioteca de cDNA

3. Preparacin de cDNA de doble cadena (ds): como se forma un hbrido de cDNAARN , el ARN que se elimina con la ayuda de la RNasa H o un tratamiento alcalino. El cDNA de hebra sencilla tiene la propiedad de formar transitororiamente un bucle de horquilla en el extremo 3 'que se usa para cebar la sntesis de la segunda hebra de cDNA, utilizando la DNA polimerasa I.

Pasos para la preparacin de la biblioteca de cDNA

4. Despus de la monocatenario molculas de ADN se convierten en ADN de doble cadena, el bucle de horquilla se retira con la ayuda de la nucleasa S1 (acta slo en cadenas simples).

Pasos para la preparacin de la biblioteca de cDNA

5.La modificacin de extremos: los extremos de cDNA de doble hebra pueden ser modificados por cola de homopolmeros de o la adicin de enlazadores y adaptadores para permitir su insercin en un vector. 6. La transformacin de las clulas husped: los vectores recombinantes que contienen los cDNA correspondientes a los ARNm, se introducen en clulas husped adecuadas.

Cuntos clones de la biblioteca genmica de cDNA deben ser examinados?

La biblioteca de cDNA se criba a continuacin, para la identificacin del clon que lleva el gen deseado. El nmero de clones que se analizarn est dado por la siguiente frmula:

Donde N representa el nmero de clones que se analizarn, p es la probabilidad de encontrar un clon, ln representa logaritmo natural y n es el nmero de molculas de mRNA en la clula.

OTRA OPCIN PAR AISLAR mRNA

OTRA OPCIN PAR AISLAR mRNA

3. SNTESIS QUMICA
Este mtodo se utiliza cuando: se conoce la secuencia de aminocidos de la protena, es decir, el producto del gen y el tamao del gen es pequeo. Sobre la base de los codones, es posible deducir la secuencia de nucletidos del gen de la secuencia de aminocidos en la protena.

3. SNTESIS QUMICA
Una vez que se dedujo la secuencia de bases del gen, el polinucletido de la misma secuencia de bases puede ser sintetizado qumicamente. Sin embargo, la degeneracin del cdigo gentico puede presentar algunos problemas y tiene que ser analizado

3. SNTESIS QUMICA
Hay tres mtodos para la sntesis qumica de genes; i) mtodo del fosfodister ii) mtodo del fosfotrister y iii) mtodo de trister de fosfito. Entre stos mtodo el de trister fosfito es el ms eficiente y se utiliza para la sntesis automtica de oligonucletidos en mquinas. Algunos ejemplos de los genes sintetizados qumicamente incluyen el de somatostatina, el interfern y el gen cry.

4. TRANSPOSN TAGGING
Los transposones son elementos genticos mviles que se encuentran tanto en procariotas como eucariotas, como por ejemplo, Tn5 en bacterias, Ac / Ds del maz.

4. TRANSPOSN TAGGING
La tcnica del transposn tagging se utiliza para la clonacin de genes cuyas funciones no se conocen. Aqu los transposones se utilizan para la induccin de mutaciones por inactivacin insercional. Los mutantes son examinados para detectar el fenotipo cambiado.

4. TRANSPOSN TAGGING
El fenotipo mutante y la posicin de la mutacin en el mapa gentico indican que el gen correcto ha sido afectado. Usando la secuencia de ADN de los transposones, se puede identificar los clones de ADN que contienen el gen diana. Por consiguiente, el gen se puede clonar.

4. TRANSPOSN TAGGING
En esta tcnica se requiere que el organismo debe tener sistema de transposn bien caracterizado, como en el maz. No es factible esta tcnica en muchas especies, incluyendo los seres humanos.

5. MAPEO BASADO EN CLONAMIENTO

El mapeo basado en la clonacin de genes tambin se conoce como clonacin posicional es el aislamiento de un gen basado nicamente en su posicin en un mapa gentico. La estrategia se utiliza cuando no hay informacin disponible sobre el gen o su producto. Sin embargo, requiere la disponibilidad de mapas moleculares. Se encuentra el gen en un cromosoma particular, a travs del anlisis con marcadores moleculares.

5. MAPEO BASADO EN CLONAMIENTO

1. Una sonda complementaria al final del clon A se utiliza para encontrar la superposicin del clon B 2. Una sonda complementaria al final del clon B se utiliza para encontrar la superposicin del clon C

In chromosome walking, neighboring genes are used to locate a gene of interest.

3. Una sonda complementaria al final del clon de C se utiliza para encontrar la superposicin del clon D que contiene el gen de inters. CONCLUSION: Al marcar las sondas complementarias a las reas de superposicin entre los fragmentos clonados en una biblioteca genmica, podemos conectar un gen de inters a un gen vinculado previamente asignada.

5. MAPEO BASADO EN CLONAMIENTO RECUERDE:

En sobre el cromosoma, un gen se asigna por primera vez en relacin con un gen previamente clonado. Una sonda hecha a partir de un extremo del gen clonado se utiliza para encontrar un clon de superposicin, que luego se utiliza para encontrar otro clon de superposicin. De esta manera, es posible bajar por el cromosoma con el gen de inters.

6. PCR
La transcripcin inversa seguida de reaccin en cadena de la polimerasa (RT-PCR) se puede utilizar para la amplificacin de secuencias de ARN en forma de cDNA. Usando cebadores especficos de genes, es posible clonar molculas de cDNA especficas del RNA celular total, sin necesidad de purificar mRNA.

6. PCR
En determinadas situaciones, tales como cuando el material de partida de ADN es muy pequeo, por ejemplo, con clulas individuales, es difcil de preparar bibliotecas genmicas mediante clonacin basada en clulas. En estos casos, la PCR es la nica alternativa disponible para el aislamiento del gen si hay cebadores especficos.

6. PCR
Sin embargo, adems de la amplificacin de fragmentos especficos, la PCR tambin se puede utilizar para generar bibliotecas genmicas al azar con la ayuda de cebadores aleatorios. Una limitacin de la PCR es que la enzima Taq polimerasa puede amplificar slo pequeos fragmentos (1-2 kb). En los ltimos aos esto ha sido superado hasta cierto punto y ha sido posible amplificar fragmentos de ADN arriba de 22 kb por el mtodo llamado long PCR.

DESCUBRIMIENTOS DE GENES POR MTODOS IN SILICO

Los genomas completos de ms y ms especies se ordenan cada ao y secuencias parciales de muchos otros organismos que continuamente se aaden a las bases de datos de ADN. The complete genomes of more and more species are sequenced each year and partial sequences of many other organisms are continually being added to DNA databases.

DESCUBRIMIENTOS DE GENES POR MTODOS IN SILICO

With this growth in sequence information, the task of finding genes is today often carried out, not using gene cloning and DNA libraries, but rather with high-speed computers that analyze and search DNA databases. Sometimes called in silico, these methods of locating and characterizing genes.