L-GLUTAMATO
INDUSTRIA ALIMENTARIA
ADITIVO ALIMENTARIO: SABORIZANTE O POTENCIADOR DE AROMA
NEUROQUIMICA
NEUROTRANSMISOR EXCITADOR DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL
Cooper and Pritchard, 1994; Zilkha et al.1995; Valero y Garcia Carmona, 1998
L-GLUTAMATO
METODOS
Kondrat et al.2002; Hanko y Rohrer,2004. Shi y Stein,1996; Liu et al, 1999; Ling, et al , 2000; Rodriguez et al. 2004
CROMATOGRAFIA
-PRE TRATAMIENTO -VOLUMEN GRANDE DE MUESTRA - TIEMPO
ENZIMATICO
GLUTAMATO DESHIDROGENASA (GDH) GLUTAMATO DESCARBOXILASA (GDC)
ENZIMA QUE CATALIZA LA DEAMINACION OXIDATIVA DEL L-GLUTAMATO EN PRESENCIA DE AGUA Y OXIGENO CON LA FORMACION DE A-QUETOGLUTARATO, AMONIO y PEROXIDO DE HIDROGENO.
RX CROMOGENICA DE PEROXIDASA
AMPEROMETRIA
Bohmer et al, 1989; Villarta et al, 1995;Almeida y Mulchandani, 1993; Chang et al, 2003
1. SELECCION DE FUENTES NATURALES DE MICROORGANISMOS PARA LA PRODUCCION DEL GLUTAMATO OXIDASA 2. INVESTIGACION DE LAS CARACTERISTICAS FISICAS BIOQUIMICAS DEL GLOD DESPUES DE LA PURIFICACION. Y
3.1 MATERIALES
AMERSHAME BIOSCIENCES Ltd. (Suecia): SP-Sefarosa Fast Flow, QSefarosa Fast Flow y Superdex 200 HR 10/30
MEDIO
COLONIAS RESISTENTES
SE DESARROLLARON EN POLVO
ESTAS CARACTERSTICAS SUGIRIERON QUE EL MICROORGANISMO DE PRODUCCIN GLOD ERAN DEL GNERO STREPTOMYCES
MEZCLA DE REACCIN: - 2 U/mL Peroxidasa de rabano (HRP) - 10 moles glutamato monosodico (MSG) - 10 moles 4-aminoantipirina (AAP) - 17.5 moles fenol en 0.1 M de buffer pH 7.4 fosfato potasico LAS COLONIAS PRODUCTORAS DE GLOD CAMBIARON LOS PAPELES FILTROS A COLOR ROJO Y FUERON RECOLECTADOS. REACCION SE LLEVO A CABO X 15-30 MIN A T C AMBIENTE SIN LUZ.
Streptomyces sp. 18G crecieron en medio precultivado de salvado de trigo descrito por Bohmer et al 1989 con algunas modificaciones.
ENSAYO DE GLOD
ACTIVIDAD DEL GLOD
Metodo descrito por Li et al, 1996
MEZCLA DE REACCIN: - 1.0 moles 4-aminoantipirina (AAP) -17.5 moles fenol - 2.5 U Peroxidasa de rabano (HRP) - 10 moles glutamato monosodico (MSG) - Suficiente cantidad de GLOD en 0.1 M de buffer pH 7.4 fosfato potasico en un volumen total de 1.30 mL. LA REACCION FUE INICIADA POR LA ADICION DE 10 moles MSG a la MEZCLA DE REACCION
CANTIDAD DE ENZIMA REQUERIDA PARA PRODUCIR 1 mol de H2O2 x min bajo las condiciones de ensayo.
Purificacin de GLOD
Concentracin de la enzima. Se utiliz la tcnica de precipitacin con Sulfato de amonio (salting out).
Sulfato de amonio pulverizado
Se dializ durante la noche con el mismo buffer Resuspendi en 20 M buffer fosfato de potasio pH6.0
Enzima refrigerada
Agit a 0C / 1Hr
precipitado
Las fracciones fueron concentradas por ultracentrifugacin y se mantuvieron en bao de hielo para las medidas adicinales de purificacin.
Las fracciones concentradas fueron primero desaladas. Columna Q sepharose Fast flow 30ml (in: grupo amino cuaternario, ternarios o secundario, matriz agarosa reticulada 6%) La columna fue lavada con 20M de buffer Tris HCl pH 8.0 a 1ml/min.
Las protenas que se unian a la columna fueron eluidas mediante gradiente salido de NaCl 0 0.1M con el mismo caudal de flujo.
Las fracciones fueron concentradas por ultracentrifugacin y se mantuvieron en bao de hielo para las medidas adicinales de purificacin.
Las partculas cargadas negativamente se unen a la matriz slida cargada positivamente y son retenidas. Mientras tanto, las partculas con carga positiva son rechazadas de la matriz eluyndose. Para regenerar la matriz, se eluyen las particulas retenidas haciendo circular una solucion salina .
Se determinaron la actividad GLOD de las fracciones por el mtodo colorimtrico y se concentraron an ms para las pruebas adicionales.
Las molculas pequeas penetran en los intersticios del gel quedando retenidas. mientras tanto, las partculas de mayor tamao, al no poder ingresar al interior del gel, son eludas. as, se consigue separar las molculas de acuerdo a su tamao molecular
Se aade una solucin de protenas a la columna que contiene el polmero reticulado Las molculas de protena son separadas por su tamao, las molculas grandes pasan con ms facilidad.
4. 1 Purificacin de la enzima
GLOD extracelular Medio de precultivo: Salvado de trigo 2% trigo, 0.5% NaCl, 0.5% MSG 30C, 60 horas, 200 rpm. Actividad: 13.79 mU/ ml
MARCADORES DE PROTEINAS
BETA-GALACTOSIDASA
GLOD PURIFICADA
1. 2. 3.
GLOD extracelular fue aislada de Streptomyces sp. 18 G. La enzima fue eficientemente producida en un medio de salvado de trigo. La enzima fue purificada aprox. 990 veces del cultivo de crecimiento con un rendimiento de 16.65%. 4. La actividad especfica fue de 152.36 U /mg. 5. La enzima nativa tiene un peso molecular de 120000 Da con dos subunidades idnticas. 6. El pI de GLOD de Streptomyces sp. 18G fue estimado en 8.5. 7. Los perfiles de actividad en cuanto a pH y temperatura: 7 7.4, 37C. Aplicable para determinacin de glutamato. 8. La enzima muestra exclusividad en la oxidacin de L- glutamato. 9. Los resultados implican que el control de las condiciones de cultivo (pH, sales, etc., pueden facilitar la produccin de GLOD. 10. Uso: biosensor de kits para anlisis clnico, monitoreo de bioprocesos y control de calidad de alimentos.