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TEMA 19- ESTRATEGIAS DE CONTROL DE ACTIVIDAD

ENZIMTICA II.
1. Introduccin regulacin por Cambios Conformacionales.

2. Interaccin protena-ligando.
2.1. Funcin de Scatchard.
2.1.1. Linearizacin de la ecuacin de Scatchard.
2.2. Ecuacin de Hill.
2.2.1. Linearizacin de la ecuacin de Hill.
2.2.2. Razn de saturacin Rs.

3.Modelo Protenas alostricas.
3.1.Modelo concertado de Monod, Wyman y Changeux (MWC)
3.1.1. Enzimas alostricas tipo K
3.1.2. Enzimas alostricas tipo V
3.1.3. Modelo alostrico mixto
3.2. Modelo secuencial (KNF).
i) Observaciones experimentales que condujeron al desarrollo
de la idea sobre los cambios conformacionales y su papel en
la regulacin de la actividad enzimtica.




ii) Modelos tericos empleados para la descripcin de este
sistema de control.

iii) Significado biolgico/bioqumico de este tipo de control.
- Observaciones experimentales
- Modelo de Monod-Wyman-Changeux
- Modelo de Koshland-Nemethy-Filmer
Regulacin por Cambios Conformacionales
I) Observaciones experimentales
* Muchas de las ideas sobre el control conformacional de la actividad
enzimtica se desarrollaron como consecuencia del trabajo sobre las vas
biosintticas de los aminocidos en microorganismos, especialmente en E.
coli.
* A mediados de la dcada de los aos 50 se descubri que la Treonina-
dehidratasa, primera enzima de la va biosinttica de la Ile, en E. coli, se
inhiba fuertemente por Ile, producto final de la va, que tiene muy pocas
analogas estructurales con el sustrato de la enzima, la Thr.
Threonine
dehydratase
L-Thr ---------> 2-Oxo-butyric acid ---> ---> --->... ---> ---> L-Ile
-
- Slo la primera enzima de la va, la treonina-dehidratasa,
muestra este tipo de inhibicin.
* Un ejemplo, semejante, se encontr en el caso de la enzima
Carbamoiltransferasa o Aspartato Transcarbamilasa
(ATCasa), enzima que cataliza la primera reaccin de la va
biosinttica de las bases pirimidnicas, en E. coli, la cual se inhibe
tambin por el producto final de la va, especialmente por CTP.
CCC
+
Active relaxed form
Inactive tense form
ATCase
R
R
R
R
R
R
CCC
COO
-
CH
2
HN-C-COO
-
H H
-

-

-

-

O
H
2
N-C-O-PO
3
2-
=

O
H
2
N-C-

=

COO
-
CH
2
N-C-COO
-
H H
-

-

-

-

Catalytic subunits
Catalytic subunits
Regulatory subunits
ATP
CTP
Nucleic acid
metabolism
Feedback
inhibition
Aspartate Carbamoyl
phosphate
Carbamoyl aspartate
CTP
CTP
CTP
CTP
CTP
CTP
Quaternary structure
* En este caso, tambin se observ que el ATP poda actuar
activando a la enzima, la ATCasa; proporcionando as un
mecanismo para conseguir el balance entre la produccin de
nucletidos purnicos y pirimidnicos, necesarios para la
biosntesis de cidos nucleicos.
* A principios de los aos 60, ya se haban descrito varios
sistemas que presentaban este tipo de regulacin, en los que
nicamente la primera enzima de la va era inhibida por
retroalimentacin o feed-back.
* El primer intento serio de unificar todas estas observaciones fue
realizado por Monod, Changeux y Jacob, y constituye uno de
los trabajos clsico de la Enzimologa.
- Monod, Changeux and Jacob (1963). J. Mol. Biol. 6, 306
- En este trabajo se resaltan los siguientes puntos o
caractersticas comunes a este tipo de sistemas:
a) El ligando implicado en la regulacin de la actividad
enzimtica (molcula reguladora o efector), generalmente, es
estructuralmente diferente del sustrato o el producto de la
reaccin que cataliza la enzima retroinhibida.
b) La mayor parte de las enzimas cuya actividad se
controla/regula por este tipo de regulacin, no muestran cinticas
hiperblicas clsicas cuando se representa v [S], sino que
muestran una cintica de tipo sigmoidal.
c) Es relativamente fcil distinguir entre la unin del efector a la
enzima y la unin del sustrato. Varios tratamientos qumicos y fsicos nos
permiten desensitizar la enzima, es decir, hacerle perder su respuesta ante
las molculas reguladoras o efectores sin que ello lleve parejo la perdida de la
actividad cataltica. As en el caso de la ACTasa un tratamiento trmico, suave,
da lugar a una enzima activa no inhibible por CTP. La enzima desensitizada
muestra una cintica hiperblica semejante a la que presentan las enzimas
michaelianas.
d) Generalmente las enzimas que se regulan por este mecanismo
son oligmeros, es decir, protenas formadas por varias
subunidades iguales o distintas, unidas entre si por fuerzas
dbiles.
* Monod, Changeux y Jacob propusieron que la molcula
reguladora o efector se une a un sitio de la enzima diferente del
centro activo, de manera que la interaccin entre la molcula
reguladora y el sustrato tiene lugar de manera indirecta o
alostrica, (del griego otra estructura).
* La unin de la molcula reguladora al sitio de regulacin
induce un cambio conformacional reversible en la enzima que
causa una alteracin de la estructura del centro activo y los
consiguientes cambios en sus propiedades cinticas.
- +
Sitio regulador
Centro activo
2. INTERACCIN PROTENA-LIGANDO
Una protena une ms de una molcula de un mismo ligando
P P P P P
L
L L
L
L
L
L
L
L L
L
K1 K2 K3 K4
K1 < K2< K3< K4 Cooperatividad positiva
K1> K2> K3> K4 Cooperatividad negativa
K1 = K2 = K3 = K4 No cooperatividad
Tratamiento de Scatchard permite calcular el nmero de sitios
de unin por molcula de protena, la constante de unin
protena-ligando y el tipo de cooperatividad



La funcin de Scatchard, , se define como la razn entre la
concentracin de ligando-unido y la concentracin total de
protena
[Ligando
unido
}
= ------------------------
[Protena]
- Esta funcin es diferente de la funcin de saturacin, que
representa el nmero de sitios ocupados partido por el nmero
total de sitios de unin que tiene la macromolcula.
N Sitios
ocupados

Y = ------------------------
N total
sitios

2.1. FUNCION DE SCATCHARD
N sitios = (concentracin de protena) x (numero de sitios por
mol de protena)
N
o
total sitios = [P] n
= Y n
En esta ec.
--> funcin de Scatchard
Y --> funcin de saturacin
n --> n sitios por mol de protena
Para deducir la ecuacin de Scatchard consideraremos una protena P, con
dos sitios de unin para el mismo ligando, L, que se unen independientemente
y con la misma afinidad a ambos sitios.
Se deduce la relacin
funcin de Scatchard
y Saturacin
L L P
L
L
L
L
P
P P
P
K
1

K
3

K
4

K
2

En el sistema no existe cooperatividad,
K
1
= K
2
= K
3
= K
4
=K
[Ligando
unido
}
= ------------------------
[Protena]



2
2
2
2
PL PL P P
PL PL P
PL PL
v
o


La funcin de Scatchard para dos lugares equivalentes viene definida por:


K[L]
= n -----------------
1 + K[L]
Deduccin Enzimologa. Pgina 224 Nuez de Castro 2001
K[L]
= 2 -----------------
1 + K[L]
Para un nmero n de lugares equivalentes de unin
n nmero de ligandos que pueden unirse por molcula de protena
K es la constante de equilibrio de unin del ligando a cada centro (es la
misma para todos los lugares de unin n que tenga la protena
[L] es la concentracin de ligando libre
2.1.1. Linearizacin de la ecuacin de SCATCHARD

[L]
=
nK - K
K[L]
= n -----------------
1 + K[L]

L nK L vK v
L nK L K v

) 1 (
Dividendo por [L] y despejando
m = - K

[L]

mM
-1
1 2 3 4
n
No cooperatividad
Representacin de Scatchard para una protena que
tiene 4 lugares de unin equivalentes
K es la constante de equilibrio de
cada uno de los sitios de unin
PERMITE
CALCULAR
NMERO DE
LIGANDOS QUE
SE UNEN POR
MOLCULA DE
PROTENA

[L]

mM
-1
1 2 3 4 5 6
n
Linearizacin de la ecuacin de SCATCHARD
Cooperatividad positiva
Cooperatividad negativa
Cuando las grficas se desvan de la linealidad
Protenas presentan cooperatividad
Clculo: EQUILIBRIO DE DILISIS, CENTRIFUGACIN
2.2. TRATAMIENTO DE HILL
Enzimas presentaban cinticas de saturacin respecto al substrato se
desviaba del comportamiento hiperblico michaeliano
Cintica sigmoidal Curva de saturacin de la hemoglobina
K [Po
2
]
nh

Y = ------------------
1 + K [Po
2
]
nh
Y es saturacin
Po
2
presin parcial de oxigeno
K constante de formacin del complejo oxihemoglobina
[Po
2
]
nh

Y = ------------------
K` + [Po
2
]
nh
K` = [Po
2
]
nh
0.5
[Po
2
]0.5 Presin da una saturacin de 0,5
nh ndice de Hill valor experimental
(hemoglobina 2,8)
Semejanza
Tratamiento de Hill
S
nh

Y = -------------
S
nh
0,5
+ S
nh
Aplicada a las enzimas con cintica sigmoidal
v
Y = ------------
Vmax
Saturacin de la enzima
[Po
2
]
nh

Y = ---------------
K` + [Po
2
]
nh
S
0,5
Concentracin substrato la saturacin
es igual Vmax
nh igual a 1 es una saturacin hiperblica michaeliana
S
0,5
= Km
S
Y = ----------- =
S
0,5
+ S

v
------------
Vmax
S
= -----------
Km + S

nh>1 Cooperatividad positiva
nh<1 Cooperatividad negativa
nh>1
nh<1
nh=1
S
vo
Vmax S
nh

vo = -----------------
S
nh
0,5
+ S
nh

1/S
1/S
1/S
1/vo
nh=1
nh<1 nh>1
2.2.1-Linearizacin de la ecuacin de Hill
5 , 0
5 , 0
5 , 0
5 , 0
5 , 0
log log
max
log
max 1
log log
1
log
1
1
S nh S nh
vo V
vo
vo V
vo
Y
Y
S nh S nh
Y
Y
S
S
S S
S
S S
S
Y
Y
nh
nh
nh nh
nh
nh nh
nh

max V
v
Y
Reaccin enzimtica la
fraccin de saturacin
Representando la ecuacin lineal
log [S]
0
Log[S
0,5
]
m = nh
La ecuacin de una recta pendiente es el ndice de Hill
S
0,5
Concentracin substrato para la cual la saturacin es igual
a de la velocidad mxima
vo V
vo
max
log
Obtencin valor experimental del ndice de Hill
Deducir la existencia de cooperatividad
Valor de S
0,5

2.2.2. Razn de saturacin Rs. Significado biolgico de la
cooperatividad positiva y negativa.
Rs, la razn de las concentraciones de substrato que dan como
resultado el 10% y 90% de saturacin

S
0,9
Rs = -----------
S
0,1

S
nh

0,1
Y = 0,1= ------------------
S
nh

0,5
+ S
nh

0,1

0,1 S
nh

0,5
= 0,9 S
nh

0,1


S
nh

0,9
Y = 0,9= ------------------
S
nh

0,5
+ S
nh

0,9

0,9 S
nh

0,5
= 0,1 S
nh

0,9

0,1 S
nh

0,9

0,9 S
nh

0,1


9 =

S
0,9
Rs = ---------- =
S
0,1
Enzima michaelianas es
constante e independiente
de Km y Vmax
nh
81
nh = 1,0 valor de Rs es igual a 81 No cooperatividad
nh = 2,0 el valor de Rs es igual a 9,0 Cooperatividad positiva
nh = 0,5 el valor de Rs es igual a 6531 Cooperatividad negativa
Enzimas con cooperatividad positiva, un cambio en la
concentracin de sustrato de 9 veces hace que la enzima pase de
una saturacin del 10% al 90% Interruptores metablicos
Enzimas con cintica hiperblica, ndice de Hill 1 se necesita
aumentar 81 veces
Enzimas con cooperatividad negativa, para que la enzima pase
de una saturacin del 10% al 90% se necesita aumentar 6561
veces. Amortiguadores de las variaciones de la [S].
Ej fosfatasa alcalina de E.coli suministra fosfato inorgnico.
3.MODELOS PROTENAS ALOSTRICAS.
Efecto alostrico: Cambios conformacionales en una
enzima dan lugar a aumento o inhibicin de la actividad
Protena alostricas actividad esta regulada por la unin no
covalente y reversible de moduladores: Se unen a sitios
distintos al sustrato
Hill no era posible determinar con exactitud las constantes de disociacin y las constantes alostricas
Transicin alostrica hace referencia a transduccin de
una seal a un lugar diferente ocupado por esa seal en la
protena.
Transicin alostrica homotrpica
cuando induce cambios en la unin del
mismo tipo de ligando
Transicin alostrica heterotrpica
cuando induce cambios en la unin del
otro tipo de ligando
3.1. Modelo concertado de Monod, Wyman y Changeaux
2. Las subunidades (protomeros) ocupan posiciones
equivalentes, de manera que dentro del oligmero, existe al
menos un eje de simetria.
3. Cada protomero posee un sitio de unin (solo uno) para cada
uno de los diferentes ligandos: Activadores o inhibidores
3. El oligmero puede existir en dos estados conformacionales,
que designaremos por R (relajada, alta afinidad) y T (tensa,
baja afinidad) y que presentan afinidad diferente por un ligando
dado.
1. Las protenas alostricas son protenas oligomricas
R T
Tensa, baja afinidad Relajada, alta afinidad
4. La conformacin de la protena cambia de de la forma R a la
forma T (o viceversa) se conserva la simetra del oligmero.
* Si representamos la conformacin de las subunidades en forma
T y R por un circulo y un cuadrado respectivamente, existe el
siguiente equilibrio:
T R
Tensa, baja afinidad Relajada, alta afinidad
Los cambios R T son concertados, no hay formas
hbridas, compuestas por subunidades (R-T)

R
T
L
5. No existirn especies hbridas (TR) ya que en tal caso se
perdera la simetra del oligmero.
*En otras palabras, todas las subunidades cambian de
conformacin de una manera concertada, lo que le ha dado
tambin nombre al modelo: Modelo concertado.
6. Las formas R y T pueden poseer diferente capacidad cataltica
(siendo k
cR
y k
cT
las constantes catalticas de las formas R y T,
respectivamente) o diferentes afinidades por los ligandos
sustratos, activadores o inhibidores.
K
R
y K
T
constantes de disociacin intrnsecas de cada uno de los
protmeros de las formas R y T y el Substrato.
* En la siguiente figura, se representa el modelo concertado ms sencillo de
una protena dimrica que tiene un activador A, y un inhibidor I:
R
T
S S
I I
L
A A
L cte de equilibrio entre las dos formas R y T.
S
S S
K
T
K
T
[T]
L = ------------
[R]
Saturacin por ligando
0.0

0.5

1.0
S
S S
K
R
K
R
S S
I I
A A
Clculo de Y
Enzimologa. Nuez de
Castro
Pg 237
kc
R

kc
T

P
P
Y La funcin de saturacin, la hemos definido anteriormente
como la razn entre el nmero de sitios ocupados partido por el
nmero total de sitios. Y= v/Vmax
Parmetros describen el estado de un sistema alostrico
L c (1+ c )
n-1
+ (1 + )
n-1
Y =
L (1+ c )
n
+ (1 + )
n-1
L cte de equilibrio entre las dos formas R y T en ausencia de ligando.
[T]
L = ------------
[R]
n nmero de sitios de unin
c constante ratio de las dos constantes de disociacin
K
R

c = ------------
K
T

Concentracin de ligando libre

[S]
= ------------
K
R
3.1.1.Enzimas alostricas modelo tipo K
R T
Tensa Relajada
Misma constante cataltica kc
R
= kc
T
R mayor afinidad por el sustrato K
R
<<<K
T
L c (1+ c )
n-1
+ (1 + )
n-1
Y =
L (1+ c )
n
+ (1 + )
n
K
R

c = ------------
K
T

C O
(1 + )
n-1
Y =
L + (1 + )
n
Y

1
Ecuacin
sigmoidal
L= 0
L= 10
L = 100
L =1000
L = 0 No hay equilibrio de transconformacin
(Todo esta como R)
la ecuacin queda reducida a Ec. M-M
Y

La presencia del ligando afecta la afinidad del enzima por el sustrato
Modifica la Km Cambia la concentracin de substrato para la cual
la saturacin es semimxima
Inhibidor desplaza el equilibrio hacia la forma T (K
R
<<<K
T
) Km
Activador desplaza el equilibrio hacia la forma R Km


Y =
(1 + )

Velocidad mxima no se ve alterada
max
1
V
v
S Km
S
Km
S
Km
S
Y

S Km
S V
v

max
(1 + )
n-1
Y =
L + (1 + )
n
Enzimas alostricas modelo tipo V 3.1.2. Enzimas alostricas modelo tipo V
Diferente constante cataltica kc
R
= kc
T
Igual afinidad por el sustrato K
R
= K
T
L c (1+ c )
n-1
+ (1 + )
n-1
Y =
L (1+ c )
n
+ (1 + )
n
K
R

c = ------------
K
T

C 1


Y =
1 +

R T
Tensa Relajada
Saturacin hiperblica
Accin de los moduladores (activadores e inhibidores)
sobre la Vmax
max V
v
Y
Vmax = k
cR
R + k
cT
T
Fosforilasa b activada por AMP
Aspartato quinasa (EC 2.7.2.4) de E.coli inhibe por
lisina
vo
S
A
I
Km
Vmax
Vmax I
VmaxA
Suma de la contribucin a la velocidad de la forma
transconformada R y de la forma transconformada T
Resumen modelo MWC
- Sencillo
-Modelo da cuenta del comportamiento de protenas que
muestran cintica sigmoide y que son oligomericas.
- Se adecua a la accin de activadores e inhibidores alostricos
Limitacin
No explica el compartamiento cintico de aquellas protenas
que tienen cooperatividad negativa.
3.1.3.Enzimas alostricas modelo tipo K mixto
Tanto la constante cataltica como la afinidad (Km) cambian
NOTA: Cintica sigmoide no es sinnimo de alosterismo. Hay protenas con cintica
sigmoide no alestericas y enzimas alostericas con cintica hiperblica (enzimas alostricas
tipo V puro)
3.2.Modelo secuencial de Koshland, Nemethy y Filmer
Ligando unido a uno de los protomeros induce un cambio conformacional
Entrada de un segundo ligando
Cooperatividad
positiva
Cooperatividad
negativa
+
-
1. Permite la presencia de formas hbridas, (prohibido en el modelo
concertado)
2. Explica tanto la cooperatividad positiva como negativa
3. Modelo concertado , sera un caso particular del modelo secuencial, en el
que se explica nicamente la cooperatividad positiva.
Ajuste
inducido
de Kosland
TRATAMIENTO DE SCATCHARD
El tratamiento de Scatchard permite el estudio de la unin de una protena con varios ligandos.
La representacin linealizada de la ecuacin permite obtener el nmero de ligando que se unen
por mol de protena, as como la afinidad de los lugares de unin.
El signo de la cooperatividad se puede obtener de la representacin linealizada
ECUACIN DE HILL
Derivada del estudio de la saturacin de la hemoglobina es til para explicar la saturacin no
hiperblica que se da en enzimas que se desvan del comportamiento Michaeliano,
monstrando curvas sigmoidales, con cooperatividad positiva, o hiprbolas no equilteras
(curvas de cooperatividad negativa).
El ndice de Hill (nh) es un parmetro experimental y no tiene que ser un nmero entero.
RESUMEN
RAZON DE SATURACIN
La razn de saturacin (Rs) entre concentraciones de substrato para dar una saturacin del
90% a una concentracin de substrato para la obtencin de una saturacin del 10% es 81, en el
caso de las protenas con cinticas michaelianas; es mucho menor para protenas con
cooperatividad positiva, y muchsimo mayor para protenas con cooperatividad negativa.
Enzimas con cooperatividad positiva puede comportarse como un interruptor metablico; por
otra parte, una protena con cooperatividad negativa puede servir para mantener el mismo flujo
a pesar de las posibles variaciones en la concentracin de substratos.
MODELO ALOSTRICO CONCERTADO

Modelo propuesto por Monod, Wyman y Changuex. Explica de forma clara y elegante la
mayor tipo de procesos alostricos de regulacin.
Esquema mecnico simple, protenas oligomricas, con ejes de simetria

Clasifica en tres tipos de enzimas alostricas.
Tipo K, son protenas oligomricas que presentan cooperatividad positiva, asi como la
accin de inhibidores y activadores.
Tipo V explica igualmente la accin de activadores e inhibidores sobre la velocidad
mxima sin cambiar la constante de afinidad por el substrato.
Tipo mixto, una mezcla de ambos modelos.

MODELO ALOSTRICO CONCERTADO

Modelo ms potente , tiene mayor complejidad , no es muy utilizado en
Enzimologa .

Prctica el instrumento ms utilizado es el ndice de Hill