Figura 24-1. Produccin de anticuerpos.

La inmunizacin de un ratn con un antgeno provoca la activacin de un conjunto de clones de linfocitos

B capaces de reconocer diversos eptopos del antgeno. El suero del ratn contiene una mezcla de anticuerpos especficos del mismo, y a este
reactivo especfico (pero policlonal) se le denomina antisuero. Si se quiere obtener un nico anticuerpo, procedente de un nico clon B hay que
seguir con la tcnica (ideada por Khler y Milstein) fusionando los linfocitos B con una lnea inmortal B (mieloma) y posteriormente seleccionando
los hbridos (hibridomas) por su supervivencia en HPRT (hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa). Este procedimiento se ve en detalle en la
animacin web. Los anticuerpos policlonales tienen un bajo coste relativo de produccin, pero su especificidad y afinidad es variable entre
sangras. Los anticuerpos monoclonales, por el contrario, son mucho ms especficos, reaccionan frente a un nico eptopo y su rendimiento en
cultivo es bajo (mucho mayor en fluido asctico del animal).
Figura 24-2. Ingeniera de anticuerpos. Para utilizar anticuerpos monoclonales en terapia no es suficiente con su produccin
en ratones. Hay que sintetizarlos mediante tcnicas de ADN recombinante. Se denominan anticuerpos quimricos los que
contienen los dominios VH y VL del anticuerpo monoclonal del ratn y todos los dominios constantes CL y HL de un anticuerpo
monoclonal humano. Hablamos de anticuerpos humanizados cuando el anticuerpo contiene slo las CDR de un anticuerpo
monoclonal de ratn injertadas dentro de una secuencia de anticuerpo humano.
Figura 24-3. Inmunodifusin radial simple. En un gel con anti-C3 policlonal se practican orificios que se rellenan con al menos
tres diluciones (A, B, C) del calibrador de concentracin conocida. En otro pocillo se siembra nuestra muestra problema (P).
Transcurridas 48-72 horas, el dimetro del anillo de precipitacin de los calibradores permite construir la recta patrn en la que
se interpola el valor observado en el ltimo pocillo, lo que nos permite calcular la concentracin de C3 en la muestra problema.
Los inmunoensayos basados en precipitacin slo son valorables en las zonas de equivalencia (equivalencia de concentracin
antgeno-anticuerpo) que es donde se forma el halo intenso de precipitacin.
Figura 24-4. La tcnica de ELISA (Enzyme-Linked-ImmunoSobernt-Assay) nos permite cuantificar protenas (antgenos o anticuerpos) en
fluidos. A. El ELISA indirecto se utiliza para cuantificar anticuerpos en suero (frente a agentes infecciosos, o frente a autoantgenos); en
estos casos se inmoviliza el antgeno en los pocillos; posteriormente se aade el suero en estudio, y finalmente un anticuerpo anti-
Inmunoglobulinas humanas conjugado con una enzima.
Figura 24.4 B. En el ELISA en sndwich vamos a poder cuantificar cualquier protena en solucin; se inmoviliza primero un anticuerpo anti-
protena, luego se aade el suero en estudio y posteriormente un segundo anticuerpo conjugado con una enzima, lo que hace que la
protena en estudio quede en un sndwich entre dos anticuerpos. En ambos casos se mide la cantidad de inmunocomplejos aadiendo un
sustrato, que ser transformado por la enzima en una sustancia coloreada. Este procedimiento se ve en detalle en la animacin web.
Figura 24-5. Western-blot. En esta tcnica se separan las protenas de la muestra mediante una electroforesis en gel de SDS poliacrilamida
(A). Seguidamente se transfieren las protenas a una membrana de nitrocelulosa en el interior de una cmara de transferencia (B). Posteriormente se aade a
la membrana un anticuerpo especfico para el antgeno que estamos estudiando, que llevar acoplada en su porcin Fc, como en el ELISA, una enzima (C).
Seguidamente se retira el anticuerpo sobrante y se aade un cromgeno que cambiar de color en presencia de la enzima (D), lo que nos permitir detectar
en la membrana la presencia de las bandas correspondientes al antgeno en estudio (E). En el ejemplo (F) las calles 1,2 y 6 tienen una protena minoritaria
ausente en las otras calles.
Figura 24-6. Inmunofluorescencia directa (A) e indirecta (B).
Los anticuerpos marcados con una molcula fluorescente pueden utilizarse para detectar la presencia de antgenos en clulas y tejidos. Cuando la
fluorescena se une directamente al anticuerpo se denomina inmunofluorescencia directa (muy utilizada en citometra de flujo, por ejemplo); sin
embargo, la indirecta utiliza un anticuerpo antiinmunoglobulina marcado para detectar un anticuerpo especfico unido a la clula o tejido (muy
utilizada en autoinmunidad).
Figura 24-7. Inmunofluorescencia Indirecta (IFI). En el diagnstico de enfermedades autoinmunes, se fijan a los portas secciones de diferentes tejidos o
cultivos celulares. Sobre dichos portas se aade el suero de los pacientes en estudio y posteriormente un anticuerpo anti-Inmunoglobulina humana conjugado
con fluorescena (reactivo de Evans). Una vez preparado el porta se estudia en el microscopio de fluorescencia y se evala la presencia o no de fluorescencia
en las clulas y/o tejidos, as como la localizacin subcelular de la fluorescencia.
Figura 24-7. En la fotografa se aprecia la tincin fluorescente del ncleo de clulas Hep-2 (lnea celular tumoral epidermoide), y adems con un
patrn homogneo. El suero en estudio tiene por tanto Anticuerpos Anti-Nucleares (ANA) homogneos.
Figura 24-8. Esquema de un citmetro de flujo. Las clulas de
una suspensin mixta (como la sangre total) se incuban con
anticuerpos monoclonales marcados con diferentes
fluorocromos. En este ejemplo se utiliza anti-CD3 con
fluorescencia roja y anti-CD8 con fluorescencia verde. Tras la
reaccin Ag-Ab la suspensin celular se hace pasar mediante
un flujo envolvente a travs del colector del citmetro, que
obliga a que las clulas pasen de una en una. A) El paso de
cada clula, atravesado por un rayo lser por una parte
dispersa luz y por otra provoca la activacin de la
fluorescencia asociada a las clulas, dando lugar a seales
que son recogidas por detectores especficos: hay detectores
para la penumbra de luz refractada que informan del
tamao/volumen celular (FS), de su morfologa y
granularidad (SS) o de la fluorescencia asociada (FMT1 y
FMT2 en la figura.
Figura 24-8.
B) El software asociado al citmetro nos permite representar las clulas en histogramas con una dimensin o con dos dimensiones
(dot-plots). Los leucocitos se pueden diferenciar de acuerdo a su volumen/tamao (FS) y a su complejidad citoplasmtica (SS).
Esto nos permite crear ventanas (como la dibujada) para su posterior anlisis; seleccionando exclusivamente las clulas que nos
interesa estudiar (en este caso linfocitos).
Figura 24-8.
C) Posteriormente se puede analizar con el software del citmetro la fluorescencia de las clulas incluidas en la ventana dibujada en B: en
este caso se representa la fluorescencia para la protena CD8, lo que nos permite distinguir tres poblaciones: CD8 negativas, CD8 positivas
con poca protena CD8 por clula (normalmente algunos linfocitos NK) y CD8 positivas con gran cantidad de protena CD8 por clula
(linfocitos T citotxicos).
Figura 24-8
D) Pero adems podemos enfrentar las fluorescencias de dos molculas (o de ms, con tres ejes). En este caso se enfrentan la expresin de
CD3 y CD8 y se aprecian cuatro nubes de puntos: CD3+CD8- (cuadrante superior izquierdo) sern los linfocitos T cooperadores; CD3+CD8+
(cuadrante superior derecho) sern los linfocitos T citotxicos; CD3-CD8- (cuadrante inferior izquierdo) sern linfocitos B
mayoritariamente; CD3-CD8+ (sern linfocitos NK mayoritariamente).
* En la actualidad se puede explorar cualquier compartimento del sistema inmune: molculas y clulas; se pueden investigar elementos de
la inmunidad innata o de la adaptativa; hay ensayos que nos permiten cuantificar la presencia de molculas y/o clulas y otros que nos
permiten estudiar su funcionalidad.
Figura 24-9. Separacin de clulas
mononucleares de sangre perifrica segn
su densidad. La sangre total se deposita
sobre Ficoll con cuidado de no romper la
separacin de fases. Tras
una centrifugacin las clulas se sitan
segn su densidad relativa. El halo
algodonoso blanquecino situado entre el
suero y el ficoll contiene las clulas
mononucleares de la sangre (linfocitos y
monocitos).
Figura 24-10. Patrones de Anticuerpos Antinucleares (ANA) ms habituales. La Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) de suero de pacientes sobre clulas Hep-2 nos
permite (en caso de reaccin positiva) clasificar los sueros segn su patrn de reactividad: homogneo, moteado, centromrico, nucleolar, etc. El siguiente paso
en el diagnstico es identificar el autoantgeno responsable de la reaccin antinuclear. Este paso se puede abordar por diferentes tcnicas (contrainmuno-
electroforesis, ELISA, inmunoblot, etc.) y segn el antgeno que d positivo en cada paciente, se puede orientar el diagnstico en uno u otro sentido. As un ANA
positivo con patrn homogneo, y que nos d anti-ADN positivo, es un resultado que dirige con casi total probabilidad al diagnstico de Lupus Eritematoso
Sistmico (SLE).
Figura 24-11. Diagnstico
diferencial de Inmunodeficiencias.
La historia clnica y/o familiar de un
paciente enfoca el despistaje
de Inmunodeficiencias. En este
esquema se simplifican los pasos
ms importantes y qu camino
tomar segn los resultados que se
obtengan. Adaptado de
Inmunodeficiencias primarias, J.E.
Lambarri y col. An Pediatr 2004; 60
(S-1): 19-23.