4.

Bacterias transgnicas
utilizadas para el desarrollo
de insumos alimenticios
Caso aplicativo, genes y rutas alteradas
Produccin bacteriana de cido
ascrbico D-eritro y cido L-ascrbico a
travs de la expresin funcional de
Saccharomyces cerevisiae D-arabino-
1,4-lactona oxidasa en Escherichia coli

BYUNG-HOON LEE, WON-KI HUH, SEONG-TAE KIM, JUNG-SHIN LEE, AND SA-OUK KANG
Resumen
La enzima D-arabinono-1,4-lactona oxidasa, que cataliza la etapa terminal en la
biosntesis de D-cido eritroascrbico en Saccharomyces cerevisiae, se expres
funcionalmente en Escherichia coli que inherentemente carecen de la enzima.
La cepa recombinante de E. coli que expresa la enzima podra producir en exceso D-
eritroascrbico y cido L-ascrbico cuando se suministra con D-arabinono-1,4-
lactona y L-galactono-1,4-lactona, respectivamente.
fisiolgica y
Bioqumica
Papeles funcionales de la vitamina C
cido L-ascrbico (ASC)
Plantas superiores y casi todos los animales
superiores con las excepciones humanos,
otros primates, cobayos, algunas aves, y
peces
Funciones conocidas o propuestas
barrenador de radicales libres
un sistema de oxidacin-reduccin en el
transporte de electrones
un cofactor para una serie de enzimas
y un factor de control en el desarrollo de
clulas de plantas
cido D- eritroascrbico (EASC)
Muy similar a la ASC en la estructura y las
propiedades fsico-qumicas
En algunos eucariotas inferiores
(Saccharomyces cerevisiae)

ALO
D-arabinosa y
D-arabinono-
1,4-lactona
oxidasa (ALO)
Esto significa que tanto EASC y ASC
pueden ser producidos por ALO
TRANSFORMACION DE E.COLI
Preparacin para DNA molde por PCR
S. cerevisiae ATCC 44774 (DNA genmico molde)
Gen ALO1 (contena un marco de lectura abierta continua de 1671 pb que
codifica un polipptido constituido por 557 aminocidos )
cebadores: 5'-TTTCACCATATGTCTACTATCC-3 '(cebador directo) y 5'-
AAGGATCCTAGTCGGACAACTC 3 '(cebador inverso).
ADN polimerasa Pwo (Roche Molecular Biochemicals) en lugar de Taq ADN
polimerasa para aumentar la fidelidad de la sntesis de ADN.
CLONACION DEL ADN DEL FRAGMENTO DEL
ADNAMPLIFICADO
El fragmento de ADN amplificado de 1,6 kb
se clon en pGEM-5Zf (+) (Promega) en el
sitio EcoRV.
A partir del plsmido resultante, se aisl un fragmento
NdeI-BamHI de 1,6 kb que contiene el marco de
lectura abierto del gen ALO1 y se lig en los sitios
NdeI-BamHI de los vectores pET-3a y pET-15b
(Novagen) para producir pET-ALO3 y pET-ALO15,
respectivamente.
Las dos construcciones finales, pET-ALO3 y pET-
ALO15, se transformaron en E. coli BL21 (DE3), BL21
(DE3) pLysS y BL21 (DE3) pLysE (Novagen).
Entre las seis combinaciones, slo BL21 (DE3) pLysS que alberga pET-ALO3 mostraron notable la
sobreexpresin de un ALO recombinante en dodecil sulfato de sodio electroforesis en gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE) en el transcurso de horas despus de la induccin con 1 mM de
isopropil--D -tiogalactopiransido