Fundamento PCR-ISSR

Ademas de los minisatelites existe otro tipo de ADN repetitivo al que se

denomina SSRs (Simple Sequense Repeats)

Al igual que los minisatlites, estas regiones estn formadas por la
repeticin en tn- dem de secuencias de ADN; pero en este caso son de
menos de 100 pb de longitud y las unidades que se repiten ms cortas
(1 a 10 pb).
El termino de microsatlite fue introducido por Litt & Luty (1989) para
describir un nuevo marcador que permite analizar estas regiones mediante
una PCR.

Para esto fue necesario disear dos cebadores de ms de 20 nucletidos
igualmente para que sean complementarios a las sequencias que
flanquean la regin SSR que se quiere amplificar.

Las condiciones de amplificacin son mas restrictivas que las empleadas en
las tcnicas RAPD, as la temperatura de unin al cebador esta por encima
de los 45C.
La tcnica consta de las siguientes
etapas;
Extraccin de
ADN
Marcaje de uno de
los cebadores con
33P
Amplificacin de el
ADN mediante PCR
Separacin de los
segmentos de ADN por
electroforesis en geles de
poliacrilamida
Visualizacin
mediante
autoradiografa
El uso de la radioactividad se puede eliminar usando cebadores
sin marcar o bien cebadores marcados con sustancias
fluoresentes.
El polimorfismo que se detecta mediante esta tcnica se debe a
diferencias en la longitud de los fragmentos amplificados que se
corresponden con variaciones en el nmero de repeticiones de la uni-
dad bsica del microsatlite en los distintos individuos analizados.
Cada longitud representa un alelo en ese locus microsatlite.

Las ventajas;
1.- la cantidad de ADN que se necesita para la amplificacin es
pequea (550 ng por reaccin).
2.- Los Loci microsatlite son muy abundantes en el genoma.
3.- son hipervariables por lo que es frecuente encontrar 4-5 o mas
alelos por locus. Esta proporciona un elevado poliformismo y pemite
distinguir muchos individuos analizando muy pocos loci
4.-son marcadores codominantes
5.-los resultados pueden ser intercambiados entre laboratorios ya
que la tecnica es altamente reproducible
6.-puede automatizarse todo el proceso
El principal inconveniente es la localizacin y caracterizacin de
microsatlites tiles, as como el diseo de cebadores adecuados.
Una vez que se dispone de los cebadores, el ensayo es sencillo y rpi-
do. Lo ms habitual es que los cebadores utilizados para analizar un
microsatlite en una determinada especie no sean utilizables en otras
especies aunque sean cercanas 1997; et al. 1997).


Otro de los inconvenientes es la imposibilidad de diferenciar entre
individuos heterocigotos y hornocigotos cuando existen nulos
debido a alguna mutacin en el lugar de unin del cebador.