Extraccin del ADN

Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern

Alianza para el Aprendizaje de Ciencias y Matemticas (AlACiMa)
Relevancia
del
Aislamiento
del ADN
La extraccin de ADN es el primer
paso en la tecnologa del ADN.
Determinacin del perfil de ADN

Clonacin

Diagnstico de enfermedades

Determinacin de secuencias de ADN

Transferencia gnica: Organismos Modificados
Genticamente (OMG), agricultura, farmacutica

Pruebas ambientales, bioterrorismo
Cules son las estructuras de una clula?
Tipos de
Clulas
Tipos de
Clulas
Tipos de
Clulas
Resumen
del
Protocolo:
Extraccin
de ADN
Genmico
Utilizacin de agua como enjuague para la
recogida de las clulas bucales

Aadir el bfer de lisis para romper las
membranas nucleares y celulares y liberar el
contenido nuclear

Utilizacin de la proteasa para digerir las
protenas celulares

Precipitacin del ADN con alcohol fro y alta
concentracin de sal.
Extraccin
de ADN :
Paso-a-
Paso
Puesto comn (Puesto del Maestro)

Bao a 50
0
C

Botella de isopropanol 91% o etanol 95%, en hielo



Puesto de trabajo de los alumnos Nmero
(4 Estudiantes/Puesto de trabajo )

Tubos de15 ml con 3 ml de agua 4

Microtubo rosa marcado prot,
con 1.25 ml de proteasa rehidratada con sal 1

Tubo de 15 ml tubo marcado lisis con 10 ml de bfer de 1


Pipetas de plstico 6

Gradilla de hule espuma para los tubos 1

Marcador de tinta indeleble 1

Taza de papel dispensable o un beaker para sostener los 1
tubos de 15 ml y la subsiguiente coleccin de basura

Materiales para hacer el collar de ADN o un micortubo de1.5ml 1

Gua rpida 1
Extraccin y
Precipitacin
de ADN

Listado de
Materiales

4 Estudiantes/Puesto de
trabajo para un total de
36 Estudiantes
Es de vital
importancia
realizar una
abundante
recogida de
clulas.

Para mejores resultados, asegrese que
los alumnos empleen la suficiente
cantidad de tiempo recogiendo las
clulas de la mucosa bucal.


Pueda que la coleccin de muestra en el
tubo de 15 mL sea difcil. Puede utilizar
un vaso pequeo para dispensar y
coleccionar la muestra.
Protocolo de
Prctica de
Laboratorio

1. Obtenga del instructor un tubo de 15 mL que
contenga 3 ml de agua. Marque el tubo con sus
iniciales.

2. Cuidadosamente mordisquee el interior de los
cachetes por 30 segundos. No sirve de nada
sacar sangre!

3. Tome el agua del tubo de15 mL, y con el agua
enjuague por 30 segundos.


4. Cuidadosamente escupa el liquido de regreso al
tubo de 15 mL.
Pasos 1 4
Protocolo de
Prctica de
Laboratorio

5. Obtenga el tubo de bfer de lisis del puesto de
trabajo y aade 2 mL de bfer de lisis a su tubo
que contiene el extracto celular.


6. Cierre el tubo e invirtalo suavemente para
mezclar los componentes. (No lo mezcle muy
duro!). Observe su tubo Ve algunos
cambios? Antelos.



Pasos 5 6
Protocolo de
Prctica de
Laboratorio

7. Obtenga el tubo de proteasa
(marcado prot) de su puesto
de trabajo. Aade 5 gotas de
proteasa a su tubo.



8. Cierre el tubo y voltelo
suavemente varias veces.



9. Coloque su tubo en la gradilla o
en un beaker en el bao de
agua y djelo incubar por 10
minutos a 50C.

Pasos 7 9
Extraccin y
precipitacin
de ADN
Por qu se lleva a cabo
cada paso?
1. Coleccin
de clulas

El mordisqueo del
interior de la boca, en
combinacin con el
enjuague de agua
funciona para separar
las clulas del epitelio
alineando la boca.

Es crtico recoger la
cantidad suficiente de
clulas.
2. Bfer de
Lisis
Qu es el Bfer de
Lisis?

50 mM Tris-HCI, pH 8.0
1% SDS
Bfer deTris para
mantener el pH de la
solucin en el cual ADN se
mantiene estable

1% SDS para romper y
abrir las membranas
celulares y nucleares
permitiendo que el ADN
quede libre en la solucin.

El detergente SDS
desnaturaliza y desdobla
las protenas dejndolas
accesibles para las
proteasas.
O
S
O
O
O
-
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
3
SDS
Na
+
3. Por qu
utilizamos la
proteasa?
La proteasa se utiliza para destruir las
protenas nucleares que crean un enlace
con el ADN y para destruir enzimas
citoplasmticas que degradan y
destruyen el ADN.


El tratamiento con proteasa incrementa la
cantidad de ADN intacto que es extrado.
4. Adicin de
la solucin
salina La solucin de proteasa ya contiene sal.

Los iones de Na
+
del NaCI forman
enlaces con los grupos de fosfato de las
molculas de ADN, neutralizando las
cargas elctricas del ADN.

La adicin de NaCI permite que las
molculas de ADN se junten en lugar de
repelerse una a la otra. De esta manera
se facilita la precipitacin del ADN de la
solucin al aadir el alcohol.
Na
+
Na+
Na+
Na+
O
CH
2

O
P O
O
O
Base
CH
2

O
P
O
O
O
Base
OH
Azcar
Azcar
O
La
Estructura
del ADN
Slo se
muestra una
cadena de
ADN.
5. Precipitacin
del ADN con
alcohol fro
El ADN no se disuelve en alcohol.

El aadir alcohol hace que el ADN se agregue y
se precipite de la solucin.

Las molculas del ADN precipitadas parecen un
material fibroso, como los hilos blancos de una
telaraa.

Las burbujas microscpicas de oxgeno, que se
generan al mezclar, se agregan al precipitarse
el ADN.

Las burbujas visibles ms grandes, levantan el
ADN fuera de la solucin y lo llevan de la fase
acuosa a la fase orgnica (fase del alcohol).
Protocolo de
Prctica de
Laboratorio

10. Lentamente aade 10 ml de alcohol fri
manteniendo el tubo a un ngulo de 45. Este paso
va a requerir de varias adiciones utilizando la
pipeta de transferencia desechable.

11. Deje el tubo en posicin vertical en la gradilla, a
temperatura ambiente y en reposo, durante 5
minutos Que ve?

12. Cierre el tubo y voltelo de lado y de regreso en
posicin vertical, con mucho cuidado, unas 10
veces, hasta que las fases de agua y alcohol
queden mezcladas y el ADN salga de solucin.
Pasos 10 12
Preparacin
de los
tapones para
los collares
1. Remueva el tapn de plstico del frasco de
vidrio.

2. Recorte las orejas de dos lados del tapn de
plstico.

3. Regrselo al frasco para crear los collares ms
tarde.

Porque?
Para que el tapn no cree una bolsa de aire
que prevenga que el frasco quede
correctamente cerrado
Preservando
la muestra
de ADN:
Preparacin
del collar de
ADN

1. Utilizando una pipeta desechable, transfiera
las fibras de ADN que ha extrado al pequeo
frasco de vidrio.

Transfiera la mayor cantidad de ADN con
la menor cantidad de alcohol posible.

El frasco se debe rellenar dejando por lo
menos 2 mm de espacio suficiente para el
tapn de plstico.
Preservando
la muestra
de ADN:
Preparacin
del collar de
ADN


2. Introduzca el tapn de plstico recortado en el
cuello del frasco y presione con firmeza para
cerrarlo

3. Deslice el cordn encerado a travs del tapn de
plata

4. Aplique una pequea gota de pegamento en el
interior del tapn de plata.
Preservando
la muestra
de ADN:
Preparacin
del collar de
ADN



5. Coloque el tapn de plata sobre la boca
del frasquito y presione con firmeza
durante 30 segundos. Deje que el
pegamento se seque durante 10-15
minutos y despus compruebe que el
frasquito est completamente sellado.

6. Cuando el pegamento se haya secado, ate
el cordn encerado.
Genes en
un Frasco
Felicidades!
Has creado un collar con tu propio
ADN!
Cunto
tiempo
dura el
collar de
ADN?
El ADN puede durar
aos en el frasquito
de vidrio. Con el
tiempo puede aadir
ms alcohol si la
cantidad original se
ha evaporado
Genes en un
Frasco
Componentes
del kit
DNA Extraction
Module (166-2000EDU):
(contains enough material for 36 students)

Lysis buffer, 150 ml

Powdered protease + salt, 1.5 g

15 ml tubes, 50

Clear, flip-top microtubes, 60

Multicolor, flip-top microtubes, 60

Disposable plastic transfer pipets, 60

Foam microtube holders, 10

Curriculum, including a teachers
guide, a graphic quick guide, and
separate student instructions for
basic and advanced-level instruction


DNA Necklace
Module (166-2200EDU):
(contains enough material for 18 DNA
necklaces; order 2 modules for a
classroom of 36 students)

Glass vials, 18
Silver caps, 18
Plastic plugs, 18
Waxed string, 18
Super glue gel, 1 tube
Instruction manual
Required Accessories Not
Included in Kit:
91% isopropanol (available from
drugstores) or 95% ethanol, 360 ml
Container of ice, 1
Permanent marker, 18

Recommended (Optional)
Accessories:
Water bath with thermometer
166-0504EDU
(166-2300EDU)
Materiales para 36
Estudiantes

Above Kit Contains:
(1) DNA Extraction
Module (166-2000EDU)

(2) DNA Necklace
Modules (166-2200EDU)