Anda di halaman 1dari 43

SEJARAH KROMATOGRAFI

Michael Tswett, Rusia ( 1903) sebagai


penemu kromatografi kromatografi
kolom memisahkan pigmen dalam daun.
Ismailov dan Schraiber, Soviet (1938)
Dasar KLT
Stahl (1956) KLT
Martin dan Synge, 1941
Kromatografi Cair (Nobel)
Martin dan James , 1952
kromatografi Gas




DEFINISI

Kromatografi bahasa Yunani
Chroma (krome) : warna
Graphein (grafi) : menulis
IUPAC Metode yang dipergunakan untuk
memisahkan komponen-komponen dari suatu
sampel campuran yang terdistribusi diantara 2
fase, yaitu fase diam (stationary phase) dan fase
gerak (mobile phase).
Teknik pemisahan fisik yang didasarkan atas
perbedaan migrasi masing-masing komponen
yang dipisahkan pada fase diam di bawah
pengaruh fase gerak.



Kromatografi merupakan salah satu teknik
pemisahan
Teknik pemisahan lain adalah
distilasi,filtrasi, ekstraksi solven,
sentrifugasi ,dll.
Tujuan utama kromatografi adalah
memisahkan dan menghitung komponen
target yang terdapat dalam sampel.

Pembagian Kromatografi Berdasarkan fase gerak
Kromatografi
Fase gerak gas Fase gerak cair
Kromatografi Gas Krom.
Kolom
K L T Krom.
Kertas
KCKT
KK.
Terbuka
KK.
Vakum
Kroma-
totron
Pembagian Kromatografi Berdasarkan pendukung fase diam
Kromatografi
Kromatografi Kolom Kromatografi Planar
Kromatografi Gas,
HPLC dsb
Kromatografi Lapis
Tipis (K L T)
Kromamatografi
Kertas (KK)
J ENIS-J ENIS KROMATOGRAFI
1. Kromatografi lapis tipis (TLC)
2. Kromatografi Kertas
3. Kromatografi lapis tipis kinerja tinggi
(HPTLC)
4. Kromatografi kolom
5. Kromatografi Gas (GC)
6. Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC)
7. Kromatografi Superkritis
Teknik pemisahan pada kromatografi melibatkan dua
fase yang tidak bercampur yaitu fase gerak dan fase
diam
Fase gerak gas atau cairan
Fase diam padat atau cairan
Dasar Pemisahan Komponen :
Perbedaan laju migrasi komponen dalam sistem
kromatografi sebagai akibat adanya perbedaan
kesetimbangan distribusi masing-masingnkomponen
diantara fase diam dan fase gerak
Perbedaan laju migrasi setiap komponen adalah akibat
perbedaan kesetimbangan distribusi masing-masing
komponen di antara fase diam dan fase gerak
Koefisien distribusi (K) :
K = Cs K1>K2, komponen tertahan
Cm pada fase diam

BAGAIMANA PEMISAHAN TERJ ADI
DALAM KROMATOGRAFI
Fase gerak -- gas atau cairan.
Dalam kromatografi terdapat dua fase :

Fase Diam
padat, berpori, material aktif permukaan
dalam bentuk partikel kecil atau pendukung
padat yang dilapisi lapisan tipis cairan.
Karena adanya perbedaan interaksi antara material
kolom dan komponen-komponen, pemisahan dapat
terjadi
Material
kolom
Komp A
Komp. B
BAGAIMANA PEMISAHAN TERJ ADI
DALAM KROMATOGRAFI
m = fase gerak
s = fase diam
Representation of a chromatographic separation
Ref. V.R. Meyer
Practical High-
Performance Liquid
Chromatography
BAGAIMANA PEMISAHAN TERJ ADI
DALAM KROMATOGRAFI

k
o
l
o
m

Sampel
campuran
Pemisahan terjadi dalam kolom
FUNGSI KROMATOGRAFI
1. Kualitatif
waktu retensi selalu konstan dalam setiap
kondisi kromatografi yang sama.
dapat digunakan untuk identifikasi.
2. Kuantitatif
luas puncak proporsional dengan jumlah
sampel yang diinjesikan dan dapat
digunakan untuk menghitung konsentrasi
3. Preparatif
Hasil Pemisahan dimanfaatkan: misalnya
untuk pemurnian senyawa untuk analisis
struktur
Kromatografi Cair (KC)
Merupakan sistem kromatografi dengan
fase gerak cairan
Kromatografi cair : Kromatografi kertas,
KLT, K Kolom, HPLC

Fakta: Kromatografi Cair digunakan 90%,
Kromatografi Gas hanya 10%, mengapa ?

Karena Kromatografi Cair
1. Mempunyai banyak mekanisme pemisahan
2. Tidak ada persyaratan analit harus menguap,
sedangkan sebagian besar senyawa
mempunyai titik didih relatif tinggi
3. Jenis alat kromatografinya banyak (lihat Bagan)
4. Teknologi tidak harus tinggi: misal KLT, KKt
5. Tidak harus mahal : KLT, KKt
KLT merupakan :
Kromatografi cair
Fase diam : padat, Fase gerak : cair
Kromatografi planar
Umumnya fase diam berupa silika gel, alumina

Lapis Tipis terdiri dari:
Plat: kaca, Alumunium, plastik
Adsorben: silika gel, alumina, selulosa, dll

Macam-macam adsorben di pasaran:
Silika gel G, silika gel GF, silika gel H
Alumina H, Alumina HF
Selulosa
Kiesel Guhr ( Tanah Diatome)

Cara tuang
Cara celup
Cara semprot
Cara penyebaran
Kriteria pemilihan :
Kemurnian
Pendekatan polaritas
Kelarutan senyawa dalam cairan pengembang
Faktor fisika kimia antara senyawa dengan
fase gerak
Bagaimana mendapatkan komposisi fase gerak
yang baik untuk KLT????
1. Cari di pustaka (jika ada)
2. Jika tidak ada, cari yang sifatnya mirip
3. Jika tidak ada yang mirip lakukan percobaan
a. Lakukan eluasi dengan fase gerak paling non polar
b. Lakukan kenaikan kepolaran secara gradien
c. Evaluasi hasil, dan tentukan komposisi yang paling baik
Mekanisme KLT (fase diam Silika /Alumina):
1. Adsorbsi senyawa pada
adsorben/penjerap/fase diam
2. Kompetisi fase gerak & solut untuk
berikatan dengan fase diam, dimana solut
lepas dari permukaan fase diam =>
desorbsi
3. Senyawa dielusi oleh
eluen/pengembang/fase gerak
Mekanisme adsorbsi
Campuran analit pertama-tama dijerapkan pada fase
diam, selanjutnya aliran fase gerak akan memaksa
analit-analit tersebut untuk bermigrasi (terdesorbsi).
Analit yang lebih polar akan lebih terikat kuat pada
fase diam yang juga polar, akibatnya kecepatan
migrasinya lambat, dibanding analit yang kurang
polar.
Sehingga => terjadi pemisahan
Dalam kromatografi adsorbsi
fase diam selalu polar (silika,
alumina)
Jika fase diam Polar,
kemudian Ada campuran
analit, dengan sifat Polar
dan lainnya non polar, maka
yang bersifat polar akan
disukai oleh fase diam
(dengan kata lain
teradsorbsi lebih kuat)
dibanding analit lain yang
kurang polar.
m = fase gerak
s = fase diam (polar)
Analit Lebih
polar
Jadi Kromatografi dengan mekanisme adsorbsi
1. Digunakan untuk pemisahan analit yang
bersifat polar
2. Fase diam yang digunakan bersifat polar:
misal Silika dan Alumina
3. Mekanismenya adsorbsi dan desorbsi
4. Jadi kalau kita menggunakan fase diam
silika pada KLT atau pun KCKT dll maka
mekanismenya adalah adsorbsi
A. Faktor penentu
Jumlah volume penotolan
Keterulangan melakukan keberulangan zat yang
ditotolkan
Jarak antar penotolan
Jarak pengembangan
Diameter penotolan
A. Titik Kritis hasil tidak maksimal
Adanya larutan yang menempel pada ujung kapiler,
akan menambah volume larutan yang ditotolkan.
Adanya efek kapiler. Terjadi karena larutan tidak
dapat menetes bebas dari ujung jarum. Biasanya ujung
jarum ditempelkan pada permukaan KLT,
menyebabkan tertariknya sejumlah larutan dari lumen
jarum

Cara Pengembangan :
Pengembangan menaik (ascending
development)
P. Horizontal (horizontal development)
Pengembangan ganda (multiple development)
Pengembangan bertahap (stepwise
development)
Pengembangan dua dimensi (twodimention
development)
Development:
Chromatographic Jars (Tanks) made of Glass with
air-tight lids of different sizes containing the
mobile phase are used for developments. The
solvent must be left in the Jars enough time before
developing the plates for saturation.
Metode normal Pengembangan plat KLT
Efek Penjenuhan plat pengembangan plat
A. Destruktif penampak bercak kimia
pereksi oksidasi/reduksi
Contoh :
Ninhidrin gugus amina primer
Dragendorff
FeCl3
A. Non destruktif
Visual analit berwarna
Deteksi dengan UV : 254 nm, 366 nm
Pembanding Rf yang sama
Rf adalah perbandingan jarak rambat komponen
dengan jarak rambat cairan pengembang. Sedang
hRf adalah Rf dikalikan seratus.

Rf = Jarak yang ditempuh senyawa
Jarak yang ditempuh fase gerak
hRf = Rf x 100

Bila 2 buah kromatogram mempunyai warna (bercak)
dengan harga Rf yang sama, maka dapat diduga
kromatogram tersebut berasal dari bahan yang
sama. Untuk meyakinkan hal ini maka harus
dilakukan pengembangan dengan sistem cairan
pengembang yang lain atau metode yang lain
KLT untuk Identifikasi
Umumnya parameter yang digunakan Rf
Totolkan, Jika ada senyawa pembanding
Gunakan lebih dari satu sistem eluen / fase gerak
Jika perlu gunakan fase diam yang berbeda
Jika mungkin gunakan penampak bercak yang
khas
Anda dapat gunakan data Rf dari pustaka sebagai
pembanding
Anda dapat menggunakan KLT Scanner untuk melihat
identitas analit
Jika perlu, anda dapat kerok dan dilakukan iden secara
fisikokimia
PENGGUNAAN KLT
KLT untuk Preparatif
Sebaiknya gunakan plat dengan fase diam yang
lebih tebal
Totolkan, jika ada senyawa pembanding
Anda dapat menotolkan sampel secara bergaris
Setelah pengembangan, masing-masing hasil
pemisahan dikerok dan dilarutkan dengan pelarut
yang sesuai.
Jangan semprot dengan bahan kimia, sebagai
penampak bercak (gunakan UV atau uap Iod)

KLT untuk Kuantitatif
Totolkan senyawa pembanding yang diketahui
kadarnya
Gunakan pipet kapiler terukur volumenya /
microsiringe
Hitung luas zona, atau itensitas dari sampel
dan bandingkan dengan senyawa pembanding
Untuk menghitung intensitas anda bisa
gunakan KLT scanner atau dikerok dan
gunakan spektrofotometer
Keuntungan :
Cepat
Peralatan sederhana
Bahan kimia yang digunakan sedikit


Kelemahan
Rf tidak tetap
Stationary phase:
Papers (cellulose), mechanism of separation is
through partition.

Mobile phase:
As TLC but more polar mixtures are usually used.
Buffers can also be used.

Sample application:
A line drawn by pencil, spot places are
determined as dots. Apply sample as in TLC.
Development:
1- Ascending: The mobile phase move against Gravity.
2-Descending: The mobile phase move with Gravity.
3-Horizontal.
4- Radial.

Visualization:
As TLC but must be non-destructive or specific with
no use of heat.

Applications:
As in TLC.
TERIMA KASIH