UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO JOO DEL REI

CAMPUS CENTRO OESTE DONA LINDU

BIOQUMICA


Prof: Helder Valadares

Microarranjos de DNA
SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)

Regianne Ferreira Silva

Divinpolis, Agosto de 2013
.




Microarranjos de DNA

O que ?

uma ferramenta para estudos de expresso gnica;

A tcnica permite a anlise dos nveis de transcritos
assim como o nmero de cpias de todos os genes de
um organismo, genotipando os milhares de variantes
de sequncias de DNA.

1995: Estudos Pioneiros


Mark Schena e colaboradores
demonstraram o uso de um
microarranjo de cDNA na anlise
quantitativa do transcriptoma de
vrias linhagens e rgos de
Arabidopsis thaliana.


Arabidopsis thaliana.
Permite a investigao de milhares de
transcritos de maneira simultnea;


Utilizada para analisar qualquer tipo de variao
na expresso gnica entre amostras, em
diferentes condies fisiolgicas e patolgicas


O Principio da tcnica baseia-se na hibridizao por
complementariedade das molculas de cido
nuclico, que ocorre entre a sonda depositada na
lmina e o seu mRNA correspondente,
transformado em cDNA, extrado das amostras a
serem analisadas e comparadas.
.




Duas maneiras de construir e utilizar os microarranjos
foram desenvolvidas:


Microarranjos de oligonucleotideos gerados por
sntese de DNA in vitro;


Microarranjos pontuais (Spotted microarrays).

.
Microarranjos de Oligonucleotdeos em Alta
Densidade

Fotolitografia

Suporte slido: lminas de quartzo; Affymetrix

Oligonucleotdeos sintetizados na lmina com tamanhos
variando em torno de 25pb (curtos) a 80pb (longos);

Centenas de arranjos individuais sintetizados em uma
nica lmina.

Chips de Oligonucleotdeos
Construindo microarranjos de oligonucleotdeos de alta densidade por fotolitografia

Investigadores tem desenvolvido novas estratgias para
construir microarranjos de oligonucleotdeos.


Agilent Technologies: tecnologia similar a uma impressora
para destribuir os nucleotdeos de cada etapa de sntese do
DNA.

NimbleGen Systems: emprega um processamento digital de
luz ao invs de mscaras.


Produzem oligonucleotdeos mais longos (50 a 70 podendo
alcanar 100 nucleotdeos).


Microarranjos Pontuais (Spotted Microarrays)

Dcada de 1990; Pat Brown e seus colegas desenvolveram uma
estratgia diferente para gerar microarranjos evoluda da
tcnica dot blot.

Surgimento de sistemas robotizados que permitiram a elaborao
de lminas com alta densidade de spots e a otimizao de
mtodos de deteco da fluorescncia, que atingiram a
sensibilidade necessria para as medidas de intensidade geradas
pelos fluorforos.


Fragmento de DNA imobilizado: Oligonucleotideos pr-
sintetizados, cDNAs produzidos em projetos de
seqenciamento, ou ainda produtos de amplificao por
PCR.

A plataforma slida mais utilizada na confeco dos arranjos
a lmina de vidro, do tipo usado em microscopia, que
depois de ter as sondas imobilizadas na sua superfcie
normalmente referida como slide ou simplesmente lmina
de microarray.

Seleo dos clones de cDNA
vindos de algum banco de
clones.

Os fragmentos selecionados so
fixados nas lminas de vidro por
um rob chamado Arrayer em
posies especficas conhecidas
como spots.

Depsito dos cDNAs nas lminas de vidro

Arrayer depositando os cDNAs nas
lminas de vidro.

Como a tcnica funciona?

mRNA a ser medido fragmentado e os fragmentos marcados
com corantes fluorescentes;

Fragmento de mRNA hibridiza com a sequncia complementar
de oligonucleotideos do microarranjo;

Intensidade de fluorescncia em cada ponto corresponde a um
gene particular e usada como uma medida da quantidade de
cada mRNA na amostra biolgica que est sendo testada.

Deteco de sinais emitidos apenas por pareamentos perfeitos;

Leitura de um microarranjo pelo scanner a laser

Microarranjo digitalizado


Basicamente, so trs as etapas envolvidas em um
experimento com microarranjos:


Preparo das amostras,


Hibridizao,


Deteco, visualizao e interpretao dos dados.


Preparo da Amostra


Extrao de mRNA: amostra teste e controle;


Transcrio reversa: iniciada com poli(dT) e incorporao
de anlogos fluorescentes de nucleotdeos;

Grupamentos qumicos fluorescentes ( fluorforos):
Cianinas 3( Cy3 verde) e Cianinas 5 ( Cy5 vermelho).
Preparo da Amostra
Hibridizao

Neste passo, o mRNA controle (marcado a verde)
juntamente com o mRNA teste (marcado a vermelho) so
vertidos sobre a superfcie da lmina de vidro;

Incubao a 42C: cDNA da mistura se liga
(hibridizao) ao DNA complementar no microarranjo.

o microarranjo lavado de modo a remover as
molculas de cDNA que no tenham encontrado alvos
complementares nas lminas.

O microarranjo est ento pronto a ser digitalizado
scanneado.

Hibridizao
Fornos Utilizados na etapa de Hibridao
Deteco,visualizao e interpretao dos dados.


Scanner CCD: Na tecnologia CCD as lminas so excitadas
com uma luz branca em toda sua extenso e uma cmera
fotografa a imagem decorrente da emisso de intensidade
proveniente dos compostos fluorescentes (Cy3 e Cy5)
presentes nos alvos (populaes celulares de interesse) que
foram utilizados para a hibridizao;



Scanner a laser: Os scanners a laser fazem uma varredura na
lmina com um raio laser nos comprimentos de onda
especficos digitalizando a imagem gerada.
Leitura do microarranjo pelo scanner a laser para digitalizao da imagem

Aplicaes e Perspectivas

Estudos de perfis de expresso gnica de todos os genes de um
determinado genoma.

Identificao de sequncias gnicas (ou mutaes)

Estudo de diferentes tipos de Cncer

Patogenicidade de Doenas Infecciosas

Indstria Farmacutica

Mapeamento Genmico



Metodologia SAGE
Serial Analysis of Gene Expression

SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)

uma tcnica que quantifica em larga escala a expresso de
genes de uma dada populao de RNAs mensageiros. Esta
tcnica gera etiquetas (tags) de cDNA que so concatenadas
(ligadas) e sequenciadas para, em seguida, serem analisadas e
anotadas.


Sistema Aberto: No exige o conhecimento prvio das sequncias
dos genes em estudo.

Baseia-se na variabilidade da extremidade 3 no-traduzida do
mRNA.

A Tcnica SAGE foi desenvolvida na Univeridade Johns
Hopkins nos Estados Unidos (centro de Oncologia) pelo Dr.
Victor Velculescu em 1995.

Baseia-se em dois princpios:

1. Uma sequncia de nucleotdeos (tag) de 9-10 pares de
bases (pb) possui informao suficiente para a identificao
de um transcrito nico, pois uma sequncia de apenas 9 pb
pode distinguir 262.144 (4
9
) transcritos.


2. A ligao (concatenao) dos tags permite a anlise
eficiente dos transcritos de um modo serial, pelo
sequenciamento de mltiplos tags contidos em um nico
clone.

1. Isolamento do RNAm

O RNA mensageiro isolado do
resto do material gnico.

O RNAm convertido em
cDNA.


Como funciona a Tcnica SAGE?
2. Gerao das Tags

Utilizando um enzima de restrio (NlaIII) os sitios CATG
so clivados.
Uma segunda enzima de restrio (BsmFI) cliva as
sequncias 10 pb a frente do stio CATG.

As Tags de so isoladas do resto do material gnico.

3. Formao de Ditags

As Tags so separadas em dois conjuntos.

Com o uso de dois adaptadores as Tags de cada conjunto so
unidas, duas a duas
4.Unio em Concatmeros e sequenciamento

As Ditags so unidas em grandes sequncias, chamadas
concatmeros e, finalmente, sequenciadas.

Concatmeros: mltiplos tags contido em um nico
gene permite uma anlise serial eficiente.

Cromatograma aps sequenciamento de Clones SAGE.
Vantagens

Potencial para definir, qualitativamente e
quantitativamente o transcriptoma de um tecido sem o
prvio conhecimento da sequncia completa;


Medida absoluta da expresso gnica;


Novos meios de otimizao tem sido publicados com o
intuito de permitir sua eficincia e permitir maiores
aplicaes.

Desvantagens


Necessidade de sequenciamento abundante para cada um
dos tecidos e/ou condies estudadas

Necessidade de quantidades significativas de mRNA para
a construo de bibliotecas de tags;

Certa inespecificidade devido ao tamanho extremamente
pequeno dos tags, alm de eventuais erros no
sequenciamento.



Nova Estratgia: MicroSAGE


Adaptao para aplicao em protocolos realizados com
amostras menores;

Simplificao devido a incorporao dos procedimentos
em um nico tubo;

Modificaes tornaram possvel analisar a expresso
gnica de amostras 500-5000 vezes menores.

Aplicaes da Tcnica

Analisar diferenas entre os padres de expresso gnica
de clulas cancerosas e clulas normais. Examinando que
transcritos esto presentes numa clula.

Permite uma anlise rpida e detalhada dos milhares de
transcritos de uma clula.

Permite comparar diferentes tipos de clulas, gerar perfis
que vo ajudar a entender as clulas saudveis e o que h
de errado em patologias.
Referncias
Watson; D. James; Myers; M. Richard (et. al); DNA Recombinante: Genes e Genomas, 3 ed., Porto Alegre,
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http://www.lce.esalq.usp.br/roseli/TUTORIAL_MICROARRAY.pdf

http://www.embl.it/training/scienceforschools/teacher_training/teachingbase/microarray_port/step_by_step_po
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http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio17/17_docg.pdf