QU ES

CLONACIN?
Proceso por el que se
consiguen copias
idnticas de un
organismo ya
desarrollado, de
forma asexual.

QU ES UNA GENOTECA?
Es una coleccin de DNA clonado, este
puede contener al menos un gen de
inters.
TCNICAS DE CLONAJE
In vivo: en la clula, en el proceso de
clonacin es frecuente el uso de clulas
procariotas


In vitro (PCR): sin presencia de clula,
esto permite hacer PCR en tubos de
ensayo.
TCNICA DE CLONAJE
(in vitro acelular)
LAS ENZIMAS MAS
UTILIZADAS SON
DNA ligasa: me forma enlaces covalentes
entre extremos 5 fosfato de un
polinucletido con el extremo 3 OH de otro
polinucletido.
DNA polimerasa termostable: enzima
capaz de transcribir y replicar DNA. Taq
polimerasa, pfu polimerasa (3exonucleasa)


ETAPAS PCR
1- Desnaturalizacin del DNA por
choque trmico.
2- TEMPLADO: Hibridacin de la hebra
de ADN con el cebador. Se
reasociacin el DNA con disminucin
de temperatura.
3- ELONGACION: Replicacin de la
hebra por una DNA polimerasa.
ESQUEMA TEMPORAL DE UNA
REACCIN DE PCR.
TERMOCICLADOR DE DNA
CMO SE HACE EL cDNA?
PCR PARA cDNA
CMO CALCULAR EL NUMERO DE
COPIAS AL FINAL DE CADA CICLO?
El proceso de PCR aumenta
exponencialmente, en unas se pueden
replicar clones exactos y en otra solo DNA
diana.
CARACTERISTICAS
Es especifica debido a la presencia de
2 cebadores en el DNA y se puede
comprobar por electroforesis:

VECTOR DE CLONACIN
Es aquella secuencia de DNA que se
recombina con el DNA diana
LOS VECTORES SE PUEDEN
DIVIDIR EN
Vectores de procariotas:
Plsmidos, bacterifagos, cosmidos


Vectores de eucariotas:
Baculovirus, YACs, virus de mamferos.
CLONACIN EN PLSMIDOS
Un vector plasmdico,
es una pequea
secuencia de cDNA de
doble cadena purificada,
que se corta con una
nucleasa de restriccin
para tener molculas
lineales
2. transfeccion, insercin
en bacterias permeables al
ADN recombinado.
DIFERENCIA ENTRE CLON DE DNA
GENMICO Y CDNA
ENZIMAS DE RESTRICCIN o
ENDONUCLEASAS DE
RESTRICCIN
Nucleasa: Especificidad analizada en tres
criterios:
3. Reconocimiento de nucleosidos, bien por la pentosa o bien por la
base nitrogenada
CARACTERISTICAS GENERALES


Las diversas enzimas de restriccin se agrupan normalmente en tres
familias, de acuerdo a sus propiedades:

CLONACIN CELULAR DE
MOLCULAS DE DNA
PREPARACIN DEL DNA PARA SU
CLONACIN
INSERTOS DE DNA: se parte de clulas
nucleadas

INSERTOS DNA COMPLEMENTARIOS
PROCEDENTE DE UN mRNA: en muchos
casos interesa clonar la secuencia codificante
de un gen para lo cual se parte de muestras
de mRNA que debe ser convertido en cDNA

PREPARACION DEL VECTOR CLONACIN:
en general un vector es una molcula de ADN
de tamao pequeo fcil de aislar y
caracterizar

PREPARACIN DEL
VECTOR DE CLONACIN
Un vector es una molcula de DNA de tamao
pequeo, fcil de aislar y caracterizar, con secuencia
y mapa de restriccin conocido. De fcil introduccin
en la clula anfitriona y una vez all con capacidad
de replicacin autnoma.
La misin del vector es unirse al fragmento de DNA
que se quiere clonar (Inserto) para facilitar su
entrada a la clula anfitriona y su replicacin.


Existen dos tipos de vectores de clonacin:
Vectores de insercin o propagacin
vectores de expresin
FORMACION DE LA
MOLCULA DE DNA
RECOMBINANTE
Unin in vitro del inserto de DNA al vector
fragmentado, mediante la ligasa.
En la practica pueden ocurrir diversos tipos de
asociacin entre fragmentos de restriccin con
extremos compatibles, todas ellas catalizadas por la
ligasa.
Para evitar la formacin de estos productos
secundarios, se acude a estrategias experimentales,
previas a la mezcla del vector e inserto.
TIPOS DE VECTORES

Su procedencia procariota o eucariota.
El tipo de clula anfitriona.
El gen de resistencia.
El tamao del DNA que admiten como inserto.
Su tipo de molcula a partir de la que se preparan:











Plsmidos: Molculas de DNA de doble hebra, de
pequeo tamao (2-5 kb) y forma circular, presentes
en forma libre en el citosol de muchas bacterias.

Bacterifagos: Virus que infectan bacterias, tiles
para conseguir alta eficiencia de clonacin. Se
pueden utilizar bajo la tcnica de Insercin o de
sustitucin.

Quimeras: Combinan caractersticas de plsmidos y
fagos para combinar las ventajas de ambos tipos de
vectores.

Cromosomas Artificiales: Diseados especialmente
para adaptarsen al gran tamao de los insertos
requeridos.
INCORPORACIN DEL DNA
RECOMBINANTE A LA CLULA
ANFITRIONA
PROPAGACIN DEL CULTIVO
Replicacin del propio genoma y la formacin de
copias del rDNA que haya podido incorporar.
DETECCIN Y SELECCIN DE
LOS CLONES
RECOMBINANTES
ARTICULO CIENTFICO
Ligation Independent Cloning:
Efficient Directional Cloning of PCR
Products

Clonaje Independiente De Ligacin:
Clonacin En Direccin Eficiente De
Productos PCR
LIC
Clonaje Independiente De Ligacin
Creados por tratamiento de una columna
vertebral linealizada con ADN polimerasa T4
en presencia de un solo dNTP.
Se Realiza mediante la utilizacin de
enzimas de restriccin, y sin protenas de
ligacin.