Ligao, permuta,

mapas genticos
Prof. Dra. Adriana Dantas
UERGS Bento Gonalves
Segregao independente


Descoberta da Ligao
William Bateson e R.C. Punnett estudaram
herana de dois genes:
Um afetando a cor da flor
(P prpura; p vermelho)
Um afetando a forma dos gros de plen
(L longo; l redondo)
Propuseram que a proximidade fsica entre
alelos dominantes e entre alelos recessivos
impedem a distribuio independente na F1.
Bateson e Punnet ~1906

PPLL (purpura, longo) X ppll (vermelha, redondo)

PpLl

Fentipos de ervilhas observados na F2

Fentipo (gentipo) Observado Proporo esperada
9:3:3:1
Purpura longo (P_L_) 4.831 3.911
Purpura, redondo (P_ll) 390 1.303
Vermelho, longa (ppL_) 393 1.303
Vermelho, redonda (ppll) 1.338 435
6.952 6.952
Bateson e Punnet ~1906

Cruzamento teste
Cis Trans
Oque esta ocorrendo?
Os fentipos desviam da proporo esperada de
9:3:3:1
No parece ser explicado pela proporo
mendeliana
Duas classes fenotpicas so maiores que o
esperado: purpura longo e vermelha redondo.
Presena de mais gametas PL e pl do que seria
produzido na distribuio independente

Teoria Cromossmica da Herana
Thomas Hunt Morgan em 1910, trouxe a primeira evidncia
para essa teoria.
Foi obtida a partir de estudos em uma mosca da fruta, a
Drosophila melanogaster.
Adequado para estudos genticos.
pequeno tamanho
baixo nmero de cromossomo
fcil criao em pequenos espaos de laboratrio
cultura de manuteno econmica
grande nmero de descendentes por gerao
grande nmero de geraes em pouco espao de tempo
possibilidade de se obter fmeas virgens logo aps a ecloso
para efetuar cruzamentos precisos.
Ligao e padro de segregao

Como a ligao afeta o padro de segregao
mendeliano?

Descoberta da ligao em Drosophila:

Morgan demonstrou que o gene para olhos brancos (w) e o gene para
asas miniatura (m) ocorrem sobre o cromossomo X;
Cruzando uma fmea de olhos brancos/asas miniatura com macho
selvagem (alelos de ambos selvagem so dominantes; olhos vermelho
asas normal)
wm/wm X w
+
m
+
/Y F
1
w
+
m
+
/wm e wm/Y
Ou seja, F
1
fmeas tipo selvagens (w
+
m
+
/wm) e machos com olhos
brancos e asas miniatura (wm/Y).
Morgan ~1911

Experimento de Morgan
Morgan cruzou moscas de linhagens puras com olhos vermelhos
(gene dominante) e de olhos brancos.

Entretanto nem toda a prognie era de olho vermelho.

Quando cruzava machos de olho vermelho da gerao F1 com suas
irms fmeas de olho vermelho produzia somente de
machos de olho branco mas nenhuma fmea de olho branco.

Explicao desse resultado - a cor de olho nessa mosca deveria ser
ligada ao sexo.

Ento existiriam cromossomos sexuais que carregariam genes como
os da colorao de olhos.
Propores desviadas

Concluses de Morgan

Valores observados se desviam muito da proporo
mendeliana prevista 1:1:1:1 INDICA LIGAO GNICA.
Morgan chamou a combinao no-parental de genes
ligados de recombinantes;
Ele esperava 50% de fentipos recombinantes se a
segregao ocorresse independentemente;
Morgan observou 900/2.441 (36,9%) de fentipos
recombinantes. Ento, concluiu que os dois genes devem
estar ligados.
Observando essa caractersticas apresentava o
mesmo padro de segregao em Drosophila:
asas pequenas (Miniature), cor de corpo amarela
(Yelow)

Morgan trouxe, portanto, como evidncia da
Teoria Cromossmica da Herana, os padres de
segregao dos genes ligados aos cromossomos
sexuais em Drosophila.

Autossomos ligados

P
pr+pr+ vg+vg+ prpr vgvg
Gametas pr+ vg+ pr vg
F
1

pr+pr vg+vg
X
As duas maiores classes so as combinaes pr+vg+ e prvg, originalmente
introduzidas pelas linhagens parentais homozigotas.

Herana dos gametas
Na herana dos genes ligados, a freqncia dos gametas de
um heterozigoto depende da taxa de crossing-over ou taxa
de recombinao que ocorre entre os cromossomos
homlogos.

Os Gametas Parentais so formados mesmo que no haja
recombinao e aparecem em maior quantidade.

Os Gametas Recombinantes so formados apenas se houver
permuta e aparecem em menor quantidade.

A Taxa de Crossing expressa em porcentagem e
corresponde a freqncia de gametas recombinantes
formados na gametognese.
Cruzamento teste
Um dos genitores (o testador) contribui com
gametas que s possuem alelos recessivos
Os fentipos da prole revelam a contribuio
gamtica do outro, o genitor duplamente
heterozigoto
Analisador se concentra na meiose de um
genitor e esquece o outro
Analise da prole F1 autofecundada, apresenta
dois conjuntos de meiose a ser considerada: um
genitor masculino e genitor feminino
Autossomos ligados

X
P
pr+pr vg+vg pr+pr vgvg prpr vg+vg prpr vgvg
F
1

1339
Parental
151
Recombinante
154
Recombinante
1195
Parental
Cruzamento teste revela a aproximao de uma proporo 1:1 entre os dois tipos
parentais e tambm entre os dois tipos no parentais
F1 usado em cruzamento teste
pr+pr+ vgvg X prpr vg+vg+

F1 pr+pr vg+vg X prpr vgvg

F2 pr+vg+ 157
prvg 146
pr+vg 965
prvg+ 1.067

Desvio da proporo
mendeliana de 1:1:1:1
Classes maiores so
as que tem um alelo
dominante
Herana simples de dois pares de alelos situados
no mesmo par cromossomico
Duas situaes:
Alelos dominantes se repelem REPULSO
Um dominante e um recessivo em cada
cromossomo

Alelos dominantes esto grudados LIGAO
Num cromossomo esto ligados os alelos
dominantes dos dois genes ou dos recessivos


pr+ vg
pr+ vg
pr+ vg+
pr vg
Posio dos genes
Na vinculao gnica a posio dos genes no heterozigoto
(AaBb) pode ser Cis ou Trans.

Estas posies tambm podem ser utilizadas para se
definir quem so os gametas parentais e os
recombinantes.
A B
a b
Posio CIS
A b
a B
Posio TRANS
Genes Ligados - Linkage
Quando dois ou mais genes,
responsveis por diferentes
caractersticas, esto localizados em
um mesmo cromossomo, a herana
chamada de Vinculao Gnica.

Nestes casos a quantidade de gametas
e portanto a freqncia da
descendncia apresentaro diferenas
em relao ao diibridismo.

Crossing-Over ou permuta a troca de
partes entre cromossomos homlogos
durante a meiose e um dos
principais fatores para a variabilidade
gentica.
Entendendo a recombinao

As disposies originais de alelos nos dois cromossomos so chamados
combinaes parentais
As duas novas combinaes so chamadas de produtos do crossing ou
recombinantes
Crossing-over
A ligao entre os genes pode ser incompleta,
pois durante a prfase I da meiose, quando os
cromossomos homlogos esto pareados,
ocorrem trocas de partes entre as cromtides
irms, num processo chamado crossing-over ou
permutao.
Essas trocas resultam na formao de gametas
recombinantes, que so cromossomos com
novas combinaes de alelos.
Recombinao intercromossmica

Distribuio mendeliana
independente causa
recombinao
intercromossmica
As duas classes
recombinantes
constituem 50% da
prole, isto 25% de cada
tipo recombinante na
prole.
Os dois genes esto em
pares separados de
cromossomos
Ligao gnica
Se no houvesse recombinao nesses genes, a proporo de
gametas formados por um duplo heterozigoto seria 50% AB e
50% ab.

No processo de segregao independente, um indivduo AaBb
produz 4 tipos de gametas, na proporo de 25% cada.

Quando ocorre um caso de ligao gnica, o indivduo AaBb
produz apenas gametas AB e ab, na proporo de 50% cada.


Recombinao intracromossmica

O crossing-over produz
recombinao
intracromossomica
Duas cromtides no-irmas
podem fazer crossing
No h crossing entre dois genes
especficos em todas as meioses,
mas qdo h, metade dos
produtos desta meiose so
recombinantes
A meiose sem crossing entre os
genes em estudo s produz
gentipos parentais.
Sinal de recombinao
intracromossmica menos de
50% - genes ligados
Com 50% - no ligados genes
em cromossomos separados
Ligao gnica
Quando h recombinao, observa-se na
descendncia uma pequena proporo de
recombinantes, por exemplo:
40% AB (parental)
40% ab (parental)
10% Ab (recombinante)
10% aB (recombinante)
Quanto mais afastado um gene estiver do outro,
maior ser a taxa de recombinao.
Formao de Gametas
Cromtides irms
Primeira diviso meitica
Segunda diviso meitica
Quatro gametas haplides
Tetrade
s
Cromossomos
Homlogos
Cromtides irms
A B
A B
a b
a b
A B
A b
a B
a b
A B A b
a B
a b
A B
A b
a B
a b
Quiasma: estrutura de
recombinao entre
cromtides no-irms
Crossing Over e Recombinao
Permuta simples
Permutas duplas envolvendo 2 cromtides
Permutas duplas envolvendo 3 cromtides
Permutas duplas envolvendo 4 cromtides
Crossing over

Mapas de ligao
Morgan observava que a proporo de prole
recombinante variava, dependente de quais genes
ligados estavam sendo estudados
Variaes na frequncia de crossing-over refletem a
distancia real que separa os genes do cromossomos
A porcentagem de recombinantes genticos produzidos
num cruzamento teste reflete a relao de ligao entre
os genes.
Stutervant desenvolveu um mtodo para descrever a
diferena de separao espacial dos genes, onde as
variaes de recombinantes determinaria as sequencias
na dimenso linear de um cromossomo

Postulado de Sturtevant
Quanto maior a distancia entre os genes ligados,
maior a probabilidade de as cromtides no-
irms se cruzarem na regio entre os genes e, e
portanto, maior a proporo de recombinantes
que seriam produzidos
Assim obtendo a frequncia de recombinantes,
obtemos uma medida de distancia do mapa
gentico de ligao entre os genes
Unidade de mapa (u.m.)
A partir da frequncia de recombinao possvel construir o
mapa gnico de um cromossomo.
Definio a distancia entre os genes para a qual um
produto de meiose em 100 recombinante.
Uma frequncia de recombinao (FR) de 0,01 (ou 1%)
definida como 1 u.m.
Uma unidade de mapa chamada centimorgan (cM)
As unidades so medidas em unidades de recombinao (UR),
morgan ou centimorgan
uma UR corresponde a 1% da taxa de recombinao

Distncia de mapa
A B
5 u.m.
A C
3 u.m.
A C B
5 u.m.
C A B
8 u.m.
Mapa baseado na recombinao A-B
Mapa baseado na recombinao A-C
Mapas com
genes combinados
possiveis
Locus gnico (loci)
Local onde o gene esta situado no
cromossomo
Locus do gene cor de olho e locus do gene
para comprimento de asa estao separados
em 11 u.m.

pr 11.0 vg
Analise em trs caracteres
O macho triplo homozigoto recessivo abc/abc
A femea tripla heterozigota dominante ABC/ABC
Geraram 1000 descendentes

Frequncia de recombinantes
A B 367/1000 = 36,7% = 36,7 Cm
B c 107/1000 = 10,7% = 10, 7 cM
A C 450/1000 = 45,0% = 45,0 cM
Podemos construir um mapa gentico a partir destes dados
Teste de dois pontos

415
92
88
405
820 Parentais
Recombinantes 180
Total 1.000
Freqncia de
recombinao
=
_____ 180
1.000
vg b
18 u.m.
Teste dos trs pontos

sc ec cv 9,1 10,5
Mapas gnico em Drosofila
Em drosfilas, encontraram as seguintes taxas de
recombinao e mapearam os genes p, v e r:


Genes
Taxa de
recombinao

Distncia
p v 17% 17 UR
p r 9% 9 UR
r v 8% 8 UR
Problema
Em Drosophila melanogaster, asa selvagem (normal)
dominante sobre asa miniatura; olho selvagem
(marrom-avermelhado) dominante sobre olho
vermelho. Fmeas selvagens puras foram cruzadas
com machos de asa miniatura e olhos vermelhos. As
fmeas da gerao F1 foram cruzadas com machos
recessivos, produzindo a seguinte descendncia:
Problema
48,5 % asa selvagem / olho selvagem
48,5 % asa miniatura / olho vermelho
1,5 % asa selvagem / olho vermelho
1,5 % asa miniatura / olho selvagem

Pergunta-se:

a) Qual a evidncia de que se trata de um caso de ligao
gnica?
b) Qual a distncia relativa entre os loci considerados?
Soluo
a) Como se trata de um cruzamento-teste, o
fentipo da descendncia determinado pelo
gentipo dos gametas produzidos pelo
indivduo com caractersticas dominantes.
Assim, os tipos de vulos que geraram cada
uma das classes de descendentes so:
Soluo
Percebe-se que no se trata de segregao
independente porque os gametas femininos no
ocorrem na proporo de 1:1:1:1 (25 % de cada tipo)
Fentipos da
descendncia
Gentipo dos
vulos
Porcentagem
selvagem / selvagem MV 48,5 %
miniatura / vermelho mv 48,5 %
selvagem / vermelho Mv 1,5 %
miniatura / selvagem mV 1,5 %
Soluo
Trata-se, portanto, de um caso de ligao gnica
incompleta, pois se formaram quatro classes
fenotpicas, duas em maior frequncia (classes
parentes) e duas em menor frequncia (classes
recombinantes)
Soluo
b) Estimamos a distncia relativa entre os dois loci
gnicos a partir da frequncia de permutao
entre eles.
A frequncia de permutao igual soma das
frequncias das classes recombinantes, ou seja,
3 % (1,5 % + 1,5 %). Assim, a distncia entre
esses dois loci de 3 UR ou 3 centimorgans.
Mapeamento gnico em eucariotos

Genes sobre cromossomos no homlogos segregam
independentemente.
Genes sobre o mesmo cromossomo (sintnicos) esto fisicamente
ligados (grupo de ligao) e podem ser herdados juntos.
Objetivo:
Analisar a freqncia de recombinao allica em cruzamentos;
Novas combinaes de alelos parentais so produzidos por
recombinao (crossing-over durante a meiose I);
Cruzamentos-teste so usados para determinar quais genes esto
ligados e criar um mapa de ligao (mapa gentico de cada
cromossomo).
Mapeamento Gentico
Mapa gentico ou cromossmico a representao da posio dos
genes no cromossomo.
Est diretamente relacionada a taxa de crossing.
Unidades de Recombinao (U.R.) ou Morgandeos (M) so as
unidades usadas para determinar a posio dos genes no cromossomo e
correspondem a taxa de crossing.

Exemplo: Em um cromossomo h a seguinte frequncia de
recombinao entre os genes A,B,C e D:

A-B 45% A-C 20% C-B 25%
B-D 5% C-D 20% A-D 40%

Qual a posio dos genes no
cromossomo?
A C D B
45M
40M
20M 20M 5M
Grupo de Ligao
Populaes de Mapeamento
Aplicao dos mapas geneticos
Guia para o sequenciamento de genomas, pois mostra a
posio de genes e dos e marcadores genticos

Tipos de mapas: Mapa Gentico de ligao e Mapa
Fsico

Identificar genes relacionados a doenas herdadas

Analisar uma srie de marcadores polimrficos em
famlias com o gene de interesse.


Como se faz?
Cromossomos individuais em muitas espcies animais tendem a
ter cerca de 100 cM de comprimento (100 x 10
6
pb)

Assim, ocorre um crossing over por cromossomo por gerao.

Marcadores localizados em cromossomos diferentes tm 50% de
chance de co-segregarem, estando a 50 cM de distncia.

50 cM o limite mnimo para se caracterizar dois marcadores
como pertencentes ao grupo de ligao (linkage group) ou ao
mesmo cromossomo.

Marcadores que co-segregam
Ainda assim, possvel, dois marcadores que se recombinem
em 50% das vezes podem estar no mesmo grupo de ligao,
desde que estejam relacionados a um terceiro marcador que
mostre menos de 50% de recombinao com cada um dois
primeiros marcadores

DNA
Primers so separados em pouca distncia,
fragmento AMPLIFICADO
100 - 1,500 bases
RAPD
Dominante
RAPD
(Random Amplified Polymorphic DNA)
A
A B
B

A
1
A
1
A
1
A
2
A
2
A
2
Marcadores dominantes
Ind. L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
0
1
0
0
1
0
0
0
1
0
1
0
0
1
1
0
1
1
0
1
0
0
1
1
0
1
1
0
1
0
1
0
1
1
0
0
0
1
0
1
1
1
1
0
1
1
1
0
0
1
0
1
0
1
1
0
0
1
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
L2
L1
L3
L5
L6
L4
L7
L8
Marcadores dominantes
QUAIS AS POLIMRFICAS?
QUAIS AS (CO)SEGREGANTES?
Anlise em gel de RAPD
Transposons
Sequncias de insero Satlites
Microssatlites
Minissatlites
Genoma
Repeties em
tandem
Repeties
dispersas
Onde esto localizados no genoma os
marcadores?
Introns
Fragmentos de
genes
RAPDs
AFLPs
outros
Genes e sequncias
relacionadas
DNA extragnico
DNA repetitivo
DNA codificante DNA no
codificante
DNA repetitivo
Microsatlites
SSR Simple Sequence Repeats
Pequenas sequncias (sequence motif) com 1 a 4 nucleotdeos
repetidos em tandem - Amplificados via PCR
Classe de marcadores moleculares mais polimrficos
Sinonmias
SSR (Simple Sequence Repeats);
STMS (Sequence Tagged Microsatellites);
SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);

Onde so encontrados ???
Mamferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma)
Plantas: (AT)n
Mitocndrias
Cloroplastos


M
homozigoto
heterozigoto


M
homozigoto
heterozigoto
Marcador co-dominante
Marcador multiallico
A
1
A
1
A
1
A
2
A
2
A
2
Marcadores co-dominantes
Ind. L1
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
1/3
3/4
2/3
3/3
1/3
1/1
1/3
1/4
3/3
1/2
1
2
3
4
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
Marcadores co-dominantes
Sequenciamento de regies microssatlites
Mapeamento gentico de ligao
Identificar marcadores genticos ligados aos genes de interesse,
nos respectivos cromossomos;
Disponibilizados para as principais espcies de importncia
agronmica;
QTLs e/ou QRLs rastreados e etiquetados,
visando uma melhoria na eficincia da seleo.

Xu & Korban, 2000
Gene Vf
(Sarna)
AFLP

CARACTERIZAO BIOLGICA
Fenotipagem (Locos de resistncia)

A) Melrose x Gala 86 plantas
B) M13/91 x Gala - 129 plantas
C) M13/91 x M46/94 -185 plantas
M9 x Marubakaido - 85 F
1
(QTLs - loci quantitativos)
A B A B
pulgo espinhos
Perfilhos uniformes
tipo spur Perfilhos uniformes
S C M
Prognie F
1
(Santa Rosa x Chatard)
Marcas segregantes
840
marcadores:
475 AFLPs
235 RAPDs
129 SSRs

Caracterizao molecular
Identificao de marcas candidatas
Desenvolvimento de um SCAR
(Sequence characterized amplified RAPD)

1) identificao de um iniciador que confere polimorfismo
a dois bulks de DNA com fentipos contrastantes,
2) o isolamento e a clonagem do fragmento amplificado
em um vetor (plasmideo),
3) sequenciamento do fragmento isolado,
4) desenho dos iniciadores de tamanho maior que os
decmeros,
5) teste final em plantas.
Validao das Marcas Desenvolvimentos de
marcadores especficos (Clonagem por mapeamento)
Seleo assistida por marcadores
(SAM)

Atributos

Isoenzimas
Protenas
de sementes

RFLPs

RAPDs

Microssatlites

AFLPs
Nvel de
Polimorfismo
baixo alto baixo-alto baixo-alto muito alto muito alto
Estabilidade
ambiental
moderada alta alta alta alta alta
Nmero de locos moderado (<50) baixo (<10) alto alto alto alto
Expresso gentica co-dominate co-dominante co-dominante dominante co-dominante dominante
Nmero de alelos por
loco
2-5 multiallico multiallico 2 multiallico 2
Distribuio no
genoma
regies de cpia
nica
regies de cpia
nica
vrias ao acaso ao acaso ao acaso
Acessibilidade
tecnolgica
muito alta muito alta mdia muito alta muito baixa mdia
Aplicabilidade no
melhoramento
rpido,
baixo custo
rpido,
baixo custo
lento,
custo mdio
rpido, baixo
custo
lento, custo alto rpido, custo
baixo

Identificao de
gentipos
baixa baixa alta muito alta muito alta muito alta
Avaliao de
germoplasma
mdia baixa alta alta alta muito alta
Mapeamento
gentico
baixa muito baixa alta alta muito alta alta
Mapeamento de
regies especficas
baixa inadequado mdia muito alta mdia muito alta
Mapeamento
comparativo
baixa inadequado muito alta baixa alta baixa
Gentica de
Autgamas
baixa baixa mdia alta muito alta muito alta
Gentica de
Algamas
mdia baixa mdia alta muito alta muito alta
Anlise Filogentica mdia baixa muito alta mdia alta mdia
Adaptado de Gepts (1993) e Ferreira & Grattapaglia (1995).
Mapas fsicos: a montagem de trechos contguos de DNA cromossmico,
Mapas fsicos
a distncia entre posies de seqncias definidas de DNA
expressa de kilo bases.
O mapa fsico final a seqncia completa.
Montagem de mapas fsicos:
Alinhamento de clones isolados aleatrios com base em perfis de
fragmentos de restrio.
Abordagem baseada em hibridizaes: uma sonda comum
usada para identificar quais numa srie de clones so
provavelmente contguos.
Sequenciamento de diferentes fragmentos de DNA e
organizao dos fragmentos pela anlise de superposies
(contigs)
Contigs podem ser estendidos pelo sequenciamento da
extremidade de clones especficos, levando identificao de
sequenced-tagged sites STSs.


5..GTPyPuAC..3
3..CAPuPyTG..5
5..AAGCTT..3
3..TTCGAA..5

Mapa de restrio:
duas molculas de DNA com o mesmo mapa de restrio devem ser
iguais.
Os diferentes fragmentos de DNA so sequenciados e a
partir
dos mesmos vo sendo contrudas as seqncias
contnuas
CONTIGS
Mapa fsico
Genoteca de
BAC/YAC
Mapa
Mapa gentico humano
O primeiro mapa gentico humano de alta resoluo
foi publicado em 1994.
Em 2.000, mais de 1milho de SNPs identificados.
Um marcador polimrfico a cada ~2.000 pb.
Marcadores genticos so geralmente considerados
como atributos do DNA:
uma seqncia especfica identificada em um dado locus
(sequence tags)
repeties simples (microssatlites)
polimorfismo de restrio
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
Mapas detalhados
de cromossomos
Arroz
Humanos
Marcador molecular
Populaes segregantes
Mapeamento de QRL/
QTL
Polimorfismo
Sele Sele o assistida o assistida
Marcador molecular
Populaes segregantes
Mapeamento de QRL/
QTL
Polimorfismo
Sele Sele o assistida o assistida
Melhoramento molecular
(molecular breeding)
Bibliotecas cDNA
Expresso gnica - RNAm
Bibliotecas cDNA
Expresso gnica - RNAm
Protema
Banco de dados