L/O/G/O

Biotecnologa de cultivos celulares

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL
INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA
Integrantes:
Hernndez Huerta Sarah
Islas Castaeda N. Andrea
Jara Aguilar David
Jimnez Hernndez Oscar
Equipo: 3 Grupo: 4FV1 20-Septiembre-2013
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Hibridacin somtica
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Hibridacin somtica
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Aislamiento de protoplastos
1.Seleccin del material de partida.

2. Tratamiento enzimtico Temperatura 25 - 30C, pH 4,7 6.
Medio con:

a) Enzimas que degradan la pared celular: Celulasas, pectinasas y
hemicelulasas.
b) Inhibidores de proteasas (PVP).
c) Estabilizador osmtico (Sorbitol o manitol).
d) Estabilizacin de membranas (CaCl2).

3. Limpieza y purificacin de los protoplastos.
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Mtodos de fusin
Qumicos
Los protoplastos de dos tipos parentales se mezclan en una solucin
conteniendo 15 a 45 % de fusgeno PEG (peso molecular de 1500 a 6000),
durante 15 a 30 minutos. La temperatura de incubacin ptima para inducir la
fusin es de 35 a 37 C pero, en la prctica, suele ajustarse a 24 C.

La remocin del PEG se lleva a cabo en forma gradual, siendo esto
fundamental para asegurar una elevada frecuencia de heterocariones. Para
ello, la suspensin se somete a sucesivos lavados con una solucin alcalina
(pH 9-11) de CaCl2 10-50 mM, disminuyendo progresivamente la
concentracin de PEG con cada lavado.
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Electrofusin
Aplicacin de corriente alterna de alta frecuencia (0,5 a 1,5 MHz). Las
cargas se separan dentro de las clulas formando un dipolo y generando,
por lo tanto, un potencial de membrana. Los
protoplastos se aproximan unos a otros y forman cadenas paralelas a las
lneas de campo aplicadas.



Mtodos de fusin
El segundo paso consiste en la aplicacin de uno o ms pulsos cortos de
corriente directa de 15 a 100 seg., con una intensidad de campo elevada (1
a 3 Kv/cm), suficiente para causar la ruptura reversible de la membrana. Para
que esto ocurra es necesario que el voltaje crtico de membrana sea
alcanzado en cuestin de nanosegundos a microsegundos. Ocurre entonces
la fusin de las dos clulas cuyas membranas estn en estrecho contacto (1 a
2 nanmetros de distancia).
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Esquema general
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Ejemplo: Dianthus
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Resumen
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Resumen
La fusin de protoplastos es una tcnica de biotecnologa en la cual se
produce la fusin de las membranas de dos o ms clulas dando lugar
a un hbrido somtico. La tcnica es ampliamente empleada para
introducir variabilidad en las cepas de inters biotecnolgico.


Esta tcnica, pese a mezclar el contenido gentico de dos lneas
distintas, no est considerada ingeniera gentica, pues en su ejecucin
no se emplea la tecnologa del ADN recombinante
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Gracias