PRODUKSI METABOLIT

SEKUNDER DENGAN KULTUR

JARINGAN TANAMAN

DR. GEMINI ALAM, MSi, Apt.

Arti judul kuliah
PRODUKSI : Membuat produk dengan
metode tertentu
METABOLIT SEKUNDER: Produk sekunder
yang dibiosintesis oleh tumbuhan tertentu
KULTUR JARINGAN TANAMAN: Teknologi
penumbuhan sel, kumpulan sel, jaringan,
atau organ pada/dalam media tertentu
secara aseptis.
LINGKUP KJT
PROPAGASI
KULTUR JARINGAN
TANAMAN
PRODUKSI
BIOKEMIKAL
DE NOVO SINTESIS
PERBAIKAN
GENETIK
HIBRIDISASI
SOMATIK
BIOKONVERSI
KRIOPRESERVASI
TANAMAN BEBAS
PATOGEN
SINTESIS DARI
PRAZAT
Menurut Dodds dan Roberts (1982) salah
satu syarat keberhasilan pada kultur
jaringan:
Pemilihan media, baik komposisi maupun
jumlahnya.
Apabila media yang dipakai sesuai,
jaringan yang ditanam akan berkembang
dan membentuk kalus.

Kalus adalah massa sel yang tidak
terdiferensiasi, terdiri dari sel-sel parenkim
yang muncul dari sel-sel jaringan induk
yang sedang membelah, dan biasanya
terjadi di tempat irisan untuk menutup luka
dalam media
Penggunaan teknik KJT kemungkinan
dapat diperoleh:
Metabolit sekunder yang identik atau
berbeda dengan metabolit sekunder
tanaman asal
kadang-kadang tidak mampu
menghasilkan senyawa spesifik dari
tanaman asalnya
Kadar yang dihasilkan dapat sama,
lebih besar ataupun lebih kecil dari
kadar tanaman asalnya

Beberapa senyawa yang sudah
berhasil diproduksi dengan KJT
Sikonin
Antrakinon
Diosgenin
Asam rosmarinat
Reserpina
Atropina
Capsaisin
Artemisinin
Lithospermum erythrorrhizon

Morinda citrifolia
Dioscorea deltoidea
Coleus blumei
Catharanthus roseus
Coptis japonicum
Capsicum frutescens
Artemisia annua
Alam dkk. (1995) tidak menemukan adanya
kuasinoid bruseolid (ZAT PAHIT) dalam
kultur suspensi sel Brucea javanica (L.)
Merr., tetapi justru menemukan alkaloid indol
tipe kantina 6-on, dimana senyawa ini tidak
didapatkan dalam tanaman asal. Demikian
halnya morfin, tidak diperoleh dalam kultur
jaringan Papaver somniferum (Kamo dkk.
dalam Staba, 1982), solasodin dalam kultur
jaringan Solanum mammosum (Isnaeni dkk.,
1986).
SINTESIS DE NOVO PADA KJT
Hormon tumbuh




N
H
COOH
Indole-3-Acetic Acid (IAA)
O COOH
Cl
Cl
2,4-Dichlorophenoxyacetic
acid (2,4-D)
COOH
-Naphtaleneacetic acid (NAA)
N
N N
H
N
NH
2
Adenin
Kinetin sintesis
N
N N
H
N
HN O
Dalam upaya produksi metabolit sekunder
lebih disukai apabila digunakan kultur
suspensi sel, yaitu mendispersikan sejumlah
kalus yang meremah (friable) ke dalam media
cair. Sel-sel dalam media cair tersebut,
selanjutnya melakukan kontak dan
berinteraksi dengan bahan kimia yang
terdapat dalam media.
Selain itu Kultur tunas (Shoot Culture) dan
Kultur akar (Root culture) dpt digunakan
untuk produksi ms tertentu
ALUR KERJA PEMBUATAN
KULTUR SUSPENSI SEL
EKSPLAN KULTUR KALUS
SUBKULTUR KALUS SUBKULTUR KALUS
KULTUR SUSPENSI
SEL
SUBKULTUR SUSPENSI
SEL
PENGERINGAN PEMANENAN
BIOMASSA
ISOLASI ANALISIS KUALITATIF
& KUANTITATIF
Eksplan
1 minggu
2 minggu
Sterilkan :
Clorox/Bayclean (NaOCl 5,25%)
Ethanol 70%
HgCl2
Ruang Inkubasi Kultur
Lampu TL 40 W
(25 3)C
PEMBUATAN KULTUR KALUS
BUAH
sterilisasi
Bayclin 30 %
Bilas
H
2
Osteril
5' 15' 3'
MS-A
2,4-D 1 mg/l
Kin 0,1mg/l
MS-B MS-D MS-E MS-F
2,4-D 1 mg/l
Kin 1mg/l Kin 0,1mg/l Kin 0,5 mg/l
Kin 1mg/l
NAA 1 mg/l NAA 1 mg/l
NAA 1 mg/l
Pertambahan
bobot tertinggi
MS-C
2,4-D 2 mg/l
inkubasi
8 minggu
BIJI STERIL
Tr-0 Tr-10 Tr-20 Tr-40 Tr-80 A1N2 A2N2 A3N1 A4 A1N3 N4
Praperlakuan
subkultur
tiap 10 hari
2,4-D 0,2 mg/l
Media suspensi
MS-C
2,4-D 2 mg/l
KULTUR SUSPENSI SEL
dicampur homogen
25 ml biomasa sel
25 ml
biomasa sel
inokulum
Media cair perlakuan
PEMBUATAN KULTUR SUSPENSI SEL
INISIASI KULTUR SUSPENSI SEL
Bahan awal adalah
kalus yang
meremah (friable).
Media yang
digunakan adalah
media cair (tanpa
agar).
Wadah berupa labu
erlenmeyer .
Labu erlenmeyer
yang digunakan
hanya diisi media
seperlima kapasitas.
Zat pengatur
tumbuh (mis,
2,4-D) ditambahkan
sebanyak
sepersepuluh kadar
dalam media padat.
Eksplan hingga suspensi sel
KONDISI KULTUR SUSPENSI SEL
Digojog berputar
pada penggojog-
berpusing (gyrotory
shaker), disebut
aerasi.
Kecepatan
berpusing 80-100
rpm, dengan
simpangan 3 cm.
Suhu ruang inkubasi
(25 3)C.
Pencahayaan dengan
lampu TL-day light 40 w
atau gelap.
Subkultur dilakukan
setiap sekitar 7 hari,
setelah diketahui kurva
pertumbuhannya.
Pengukuran tinggi
enapan dengan alat
tertentu.
ROTARY SHAKER
ALAT PENGUKUR TINGGI ENAPAN
SUSPENSI SEL
(GAMBAR SKEMATIS)
SUBKULTUR SUSPENSI SEL
Suspensi sel dienapkan, bila tidak terjadi
kontaminasi cairan di atas enapan jernih.
Secara aseptis media lama dituang,
kemudian diganti dengan media segar
sebanyak 2 kali volum media yang dituang,
dipindah dalam wadah dengan kapasitas
2xlipat.
Wadah media ditutup kembali dan
diinkubasikan pada penggojog-berpusing.
Subkultur diulang sampai diperoleh
biomassa yang dikehendaki.
PEMBUATAN KURVA PERTUMBUHAN
Diukur tinggi enapan pada saat inisiasi kultur
suspensi sel
Diukur tinggi enapan setelah setiap 3-5 hari.
Disarankan agar kultur suspensi sel sudah
dalam wadah dengan kapasitas 250-300 ml.
Pengukuran endapan dengan alat, dihitung
sampai mm saja.
Buat poligon antara waktu versus tinggi
enapan.
GAMBAR KURVA PERTUMBUHAN
Biomasa (g bbk)
stationary phase

lag phase
death phase


log phase


Waktu (hari)
PENDEKATAN UNTUK
MENINGKATKAN PRODUK
Optimisasi kondisi kultur
Seleksi galur sel unggul
Penambahan prekursor (prazat)
Elisitasi
Penerapan sel amobil
Sekresi produk
Mutagenesis
Kultur organ dan kultur akar berambut

OPTIMISASI KONDISI KULTUR
1. MEDIUM
a. manipulasi nutrien (makro dan/ mikro)
b. manipulasi zat pengatur pertumbuhan
c. manipulasi zat organik tambahan
2. SUHU, pH, CAHAYA, OKSIGEN
3.KULTUR DNG KERAPATAN SEL TINGGI
4. PENJERAPAN PRODUK (misalnya
dengan XAD-7)

SELEKSI GALUR SEL YANG
PRODUKTIVITAS TINGGI
DENGAN PENERAPAN KLONING SEL
DENGAN AGAR PLATING

SELEKSI DAPAT DILAKSANAKAN SECARA
MANUAL ATAU INSTRUMENTAL
a. Manual: melihat warna dan bentuk agregat
atau koloni sel untuk penghasil m.s. bewarna.
b. Dengan alat yang peka, misalnya dengan
metode RIA dan ELISA.
PENAMBAHANAN PRAZAT dan
BIOTRANSFORMASI
Berdasarkan biosintesis ms dapat diumpankan
prazat untuk menjadi produk yang lebih cepat
dengan kultur suspensi sel.
Mengubah senyawa awal menjadi senyawa baru
yang lebih bermanfaat dengan pertolongan
suspensi sel.
Mengubah senyawa tertentu menjadi senyawa
lain untuk menggantikan reaksi dengan kultur
suspensi sel.



PERLAKUAN DENGAN ELISITOR
(ELISITASI)
Elisitor adalah senyawa asing yang bila
dikenakan pada sel tumbahan maka sel
tersebut akan menghasilkan fitoaleksin.
Senyawa tersebut dapat berasal dari
dinding sel kapang.
Pembuatan elisitor dapat dengan
autoclaving kapang atau homogenat
kapang.
CONTOH ELISITASI DALAM
KULTUR SUSPENSI SEL
Peningkatan produksi diosgenin dengan ekstrak
khamir (yeast extract) dalam kss Dioscorea
deltoidea.
Peningkatan produksi alkaloid dengan
homogenat kapang Botyris sp. dalam kss
Papaver somniferum.
Peningkatan kadar asam rosmarinat dengan
ekstrak khamir dalam kss Lithospermum
erythrorhizon.
PENJERAPAN SEL AMOBIL
Bahan awal adalah kultur suspensi sel yang
seragam.
Sel-sel dibuat amobil dengan teknik penjerapan.
Dalam bentuk matriks, sel-sel akan mengalami
hambatan untuk reorganisasi dan diferensiasi.
Dalam keadaan dijerap sel mengalami hambatan
dalam transfer massa.
Amobilisasi sel dapat digunakan sebagai
alternatif dalam mengatasi problem dalam
produksi ms dalam sekala besar dengan tenik kss.
SEKRESI PRODUK
Kebanyakan ms dihasilkan dalam kss
diakumulasi intraselular.
Hal ini menghambat produksi ms selanjutnya.
Perlu dicari upaya untuk mengsekresi produk ke
medium.
Caranya:
Menambahkan DMSO atau Triton X-100
Elektroporasi
Ultrasonifikasi
Mengungkapkan mekanisme akumulasi produk
dalam sel.

MUTAGENESIS
Seleksi mutan dilakukan dengan
pengumpanan dengan senyawa yang
bukan metabolit (antimetabolit).
Sel yang tahan (tetap hidup) terhadap
antimetabolit dipilih dan dianggap sebagai
mutan.
Mutan digunakan sebagai sel awal yang
diharapkan dapat memproduksi ms tinggi.
KULTUR ORGAN DAN KULTUR
AKAR BERAMBUT (HAIRY ROOT
CULTURES)
KULTUR ORGAN: AKAR DAN TUNAS (SHOOT)
KULTUR AKAR BERAMBUT:
- dengan menggunakan Agrobacterium
rhizogenes
- diharapkan akan memproduksi ms tinggi
- ingat tentang Dinamika Sel
Totipoten