ESTRUCTURA DEL DNA

Y MECANISMO DE REPLICACIN
El DNA es un polmero de
deoxiribonucleotidos unidos a
travs de enlaces fosfodiester.

Mathews y col., Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Pearson, 2002

DNA (cido desoxiribonucleico)
contiene la informacin gentica
para cada clula en un organismo.



ESTRUCTURA DEL DNA
Adenina y guanina son bases pricas presentes en el DNA y
RNA.
Mathews y col., Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Pearson, 2002
Citosina es una base pirimdica presente en el DNA y RNA.
Timina es una base pirimdica presente slo en el DNA.
Mathews y col., Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Pearson, 2002

Mathews y col., Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Pearson, 2002
ESTRUCTURA DEL DNA
Los acidos nucleicos se consideraron simplemente como una
clase de sustancia estructural del ncleo celular.

Se pensaba que era ms probable que los genes estuvieran
conformados por protenas, ya que son molculas ms
complejas que el DNA.

ESTRUCTURA DEL DNA
En 1868, Miescher aisl una sustancia que contena fsforo a partir de
ncleos de clulas del pus (leucocitos) obtenidas de vendajes quirrgicos,
a la que denomin nuclena.

Encontr que la nuclena estaba formada por una parte acdica, que
conocemos actualmente como DNA, y una parte bsica, de protena.

Ms tarde, encontr una sustancia acdica similar en la cabeza de las
clulas del esperma de salmn. A pesar de que purific parcialmente la
nuclena y se estudi sus propiedades, la estructura covalente (primaria)
del DNA se conoci hasta finales de la dcada de 1940.



El DNA es una doble hlice
Rosalind Franklin y Maurice Wilkins utilizaron la difraccin de
rayos X para analizar fibras de DNA.

Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
Complementaridad de las cadenas del DNA
de doble hlice
A=T y G=C

Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
La doble hlice o el dplex del DNA se mantiene unido por dos tipos de
fuerzas:

Los enlaces de hidrgeno entre las bases complementarias
Las interacciones de apilamiento de las bases



Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
El DNA adopta diferentes formas
tridimensionales
El DNA es una molcula flexible.

Las fluctuaciones trmicas pueden provocar la curvatura, el estiramiento y
el desapareamiento de las hebras.

Se puede observar desviaciones significativas de la estructura de Watson y
Crick y muchas de ellas pueden jugar un papel importante en el
metabolismo del DNA.

Las variaciones estructurales no tienen en general un efecto sobre las
propiedades fundamentales del DNA definidas por Watson y Crick: la
complementaridad de las hebras antiparalelas y el requerimiento de pares
de bases A=T y G=C
Los tres modelos de replicacin del DNA
Conservativa: Una de las dos estructuras de doble
cadena hijas es la doble cadena conservada del
progenitor, mientras que la otra se sintetiza de
novo.

Semiconservativa: Conserva la mitad del material
original en cada una de las dos copias.

Dispersivo: El material del progenitor se dispersa
por las estructuras de las dobles cadenas hijas.
Mathews y col., Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Pearson, 2002
La sntesis del DNA progresa en direccin
5 3 y es semidiscontinua

Una hebra nueva de DNA se sintetiza siempre en la direccin 5 3 . El molde es ledo en
direccin opuesta, 3 5. La cadena complementaria a la hebra conductora se sintetiza
ininterrumpidamente, en la direccin seguida por la horquilla de replicacin. La otra hebra
(rezagada) es sintetizada de manera discontinua en trozos cortos (fragmentos de Okazaki, los
cuales son unidos despus por la DNA ligasa. Los fragmentos de Okazaki tienen longitud de
1000-2000 nt en bacterias y de 150-200 en cls. eucariticas).
Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
Nucleasas o DNAsas:
enzimas que degradan al DNA.

Exonucleasas:
Degradan los cidos nucleicos desde un extremo de la molcula. Muchas
actan slo en direccin 5 3o bien en direccin 3 5, eliminando
nucletidos slo del extremo 5o del 3, respectivamente, de una cadena
de cido nucleico de cadena doble o sencilla.

Endonucleasas:
Degradan en sitios internos especficos de una cadena o molcula de cido
nucleico, reducindola a fragmentos ms pequeos.

DNA polimerasa:
enzima capaz de sintetizar DNA.
REPLICACIN DEL DNA



Fragmento de Klenow
(cuando se elimina este
dominio, se retienen las
actividades de
polimerizacin y de
correccin de pruebas).
Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
7
REPLICACIN DEL DNA
Subunidades de la DNA polimerasa III de E. coli.

e
Actividad polimerizante
Actividad exonucleasa 35
correctora de pruebas

Unin estable del molde,
dimerizacin de la enzima ncleo
Cargador de la abrazadera
Abridor de la abrazadera
Cargador de la abrazadera
Interaccin con SSB
Interaccin con y X
Abrazadera del DNA necesaria
para una procesividad ptima.
Polimerasa ncleo
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1
Etapas en la replicacin en E. coli
Inicio. El origen de la replicacin de E. coli (oriC), consta de 245 pb, que contienen
secuencias muy conservadas entre los orgenes de replicacin bacterianos.
Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
Tandem: repeticiones que se ordenan de manera consecutiva, de modo que secuencias idnticas, o casi, se disponen
unas detrs de otras.

Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
*
(a). Alrededor de 20 molculas de la protena DnaA cada
una de ellas ligado a un ATP, se unen a las cuatro
repeticiones de 9 pares de bases. El DNA est
enrollado alrededor de este complejo.

(b). Las tres repeticiones de 13 pares de bases ricas en
A=T se desnaturalizan seguidamente de forma
secuencial.

(c). Hexmeros de protenas DnaB se unen a cada hebra
con ayuda de la protena DnaC. La actividad helicasa
de la DnaB desenrolla an ms el DNA como
preparacin para el cebado y la sntesis de DNA.
priming: cebado
Modelo de inicio de la replicacin en el origen oriC
Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
El inicio es la nica fase de la replicacin que se sabe que est
regulada para que slo tenga lugar una vez en cada ciclo celular.

El mecanismo de regulacin no se conoce con exactitud, pero se
conoce que el inicio de la replicacin se ve afectado por al
metilacin del DNA y por interacciones con la membrana plasmtica
bacteriana.

El DNA de oriC es metilado por la metilasa Dam que metila la
adenina en N
6
.
Inmediatamente despus de la replicacin, el DNA es semimetilado:
las hebras parentales tienen las secuencias oriC metiladas, mientras
que las hebras de nueva sntesis no las tienen.

La secuencias oriC semimetiladas son secuestradas temporalmente
a travs de la interaccin con la membrana plasmtica (mecanismo
desconocido).

Al cabo de un tiempo, oriC es liberado de la membrana plasmtica y
debe ser metilado completamente por la Dam metilasa antes de
que pueda unirse de nuevo a DnaA.

Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
Etapas finales de la sntesis de los segmentos de
la hebra rezagada
Los cebadores de RNA de la hebra rezagada son eliminados por la
actividad exonucleasa 53de la DNA polimerasa I, siendo reemplazados
por DNA mediante la misma enzima.
Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
Fase de terminacin
Finalmente, las dos horquillas de replicacin del cromosoma circular de
E. coli se encuentran en una regin terminal que contiene mltiples
copias de una secuencia de 20 pares de bases denominada Ter (por
terminal).

Estas secuencias actan como una especie de trampa ya que las
horquillas de replicacin pueden entrar pero no salir.

Las secuencias Ter son sitios de unin para una protena denominada
Tus, el complejo formado Tus-Ter puede detener la horquilla de
replicacin.


Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
Fase de terminacin

Slo acta un complejo Tus-Ter por ciclo de replicacin y actuar con la
primera horquilla con la que se encuentre.

Dado que las horquillas que se mueven en direccin opuesta se
detienen al encontrarse, parecera que las secuencias Ter no son
esenciales, pero es posible que sirvan para evitar la sobrerreplicacin
por una de las horquillas, en el caso de que la otra horquilla se haya
retrasado a causa de daos al DNA.

Fase de terminacin
La separacin de los crculos encadenados
requiere la accin de las topoisomerasas.
En E. coli, una topoisomerasa de tipo II,
llamada DNA topoisomerasa IV, tiene un
papel principal en la separacin de los
cromosomas encadenados; corta
transitoriamente las dos hebras de uno de
los cromosomas, permitiendo que el otro
cromosoma pase a travs de la rotura.
Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
Caractersticas de las DNA polimerasas en
eucariotas
DNA polimerasa

La DNA polimerasa est formada por varias subunidades.

Una de las subunidades presenta actividad primasa y la subunidad mayor
(180,000) contiene la actividad de polimerizacin.

Carece de actividad exonucleasa 35, (lo que la hace inadecuada para
realizar una copia fiel del DNA), por lo que posiblemente slo acte en la
sntesis de cebadores cortos para los fragmentos de Okazaki.




Caractersticas de las DNA polimerasas en
eucariotas
DNA polimerasa

Estos cebadores son alargados por la DNA polimerasa , la cual est
asociada a una protena denominada antgeno nuclear de proliferacin
celular.

La funcin de esta protena es similar a la de la subunidad , pues forma
una abrazadera circular que potencia la procesividad de la polimerasa.

Presenta actividad de exonucleasa 35 correctora de pruebas (forma un
complejo anlogo al que forma la DNA polimerasa III en bacterias).




Caractersticas de las DNA polimerasas en
eucariotas
DNA polimerasa


La DNA polimerasa puede reemplazar a la DNA polimerasa para la
reparacin del DNA.

Tambin puede actuar en la horquilla de replicacin, tal vez con un papel
anlogo al de la DNA polimerasa I bacteriana, eliminando los cebadores de
los fragmentos de Okazaki.




ESTRUCTURA DEL RNA

Y MECANISMO DE TRANSCRIPCIN
Mathews y col., Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Pearson, 2002
El RNA desempea sus funciones en forma de cadena sencilla, U en lugar de T, grupo hidroxilo en la posicin 2.
ESTRUCTURA DEL RNA
Los nucletidos del RNA contienen el azcar ribosa.
Bases: adenina, guanina, citosina y uracilo.

Los deoxiribonucletidos contienen el azcar
deoxiribosa. Bases: adenina, guanina, citosina y
timina.
Transcripcin
Consta de tres fases al igual que la replicacin:

Inicio. Fase de unin al DNA e inicio de la sntesis de RNA.
Elongacin
Terminacin

El inicio se produce cuando la RNA polimerasa se une a
secuencias especficas denominadas promotores.

Dentro de los segmentos transcritos slo una de las hebras del
DNA sirve de molde.
Transcripcin por la RNA polimerasa en
Escherichia coli.
B
Burbuja de transcripcin
B
Hebra no molde
B
Enrollamiento
B
Hbrido
RNA-DNA 8pb
Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
Cambios en el superenrollamiento del DNA
provocados por la transcripcin
El desplazamiento de una RNA polimerasa a lo largo del DNA tiende a crear vueltas
superhelicoidales positivas y negativas. Las topoisomerasas eliminan rpidamente las
vueltas superhelicoidales positivas y regulan el nivel de superenrrollamiento negativo.
Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
Cadenas molde y no molde (codificante)
del DNA
El transcrito de RNA se sintetiza sobre la hebra molde complementaria,
siendo idntico en secuencia (con U en lugar de T) a la hebra codificante o
no molde.
Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
RNA polimerasa dependiente de DNA de E. coli
(holoenzima)
Es una enzima complejo (cinco
subunidades,
2
; 390,000).

Contiene una sexta subunidad (),
cuyas variantes se designan por su masa
molecular, la ms comn tiene un peso molecular de 70,000.

La subunidad , se une transitoriamente a la enzima ncleo y la dirige hacia
sitios especficos de unin en el DNA.
Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
Las RNA polimerasas carecen de un sitio activo con actividad exonucleasa
35 (correctora de pruebas).

Por ello la tasa de error en la transcripcin es mayor que en la replicacin
del DNA (aprox. 1 error por cada 10
4
o 10
5
ribonucletidos incorporados al
RNA).

Sin embargo, dado que de un solo gen se producen muchas copias de RNA
(y todos son finalmente degradados y reemplazados), un error en el RNA
tiene menos consecuencias para la clula que un error en la informacin
permanente almacenada en el DNA.

A pesar de no tener una funcin correctora per se, la RNA polimerasa
bacteriana y la RNA polimerasa II eucaritica, se detienen cuando se
aade una base no apareada durante la transcripcin y pueden eliminar
nucletidos no apareados del extremo 3 de un transcrito, por inversin
directa de la reaccin de polimerizacin; aunque no se sabe en que
medida contribuye a la fidelidad del proceso.

Promotores tpicos de E. coli, reconocidos por la
holoenzima de una RNA polimerasa
Promotores: Secuencias especficas del DNA al que se une la RNA polimerasa, las cuales dirigen la
transcripcin de segmentos adyacentes del DNA.
Elementos UP (upstream): Presentes en la regin entre -40 y -60, estimulan fuertemente la
transcripcin en los promotores que los contienen. Secuencias ricas en A y T.
Regin -10 y -35: Sitios de interaccin importantes para la subunidad
70
.

Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
Inicio y elongacin de la transcripcin por la RNA
polimerasa de E. coli
La RNA polimerasa se une al promotor y forma
sucesivamente un complejo cerrado (DNA unido
intacto) y un complejo abierto (DNA unido intacto,
pero parcialmente desenrrollado cerca de la
secuencia -10).

Empieza la transcripcin dentro del complejo, que
va acompaada por un cambio de conformacin
que transforma el complejo en la forma propia de
la elongacin.

El movimiento del complejo de transcripcin lo
aleja del promotor.

La subunidad se disocia cuando la polimerasa
entra en la fase de elongacin de la transcripcin.
Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
Activacin de la transcripcin
La unin de protenas a secuencias prximas o lejanas al
promotor tambin puede afectar a los niveles de expresin
gnica.

La unin de protenas puede activar la transcripcin, al
facilitar la unin de la RNA polimerasa. Ej. protena receptora
de AMPc, que aumenta el metabolismo de azcares que no
sean de glucosa cuando las clulas se incuben en ausencia de
glucosa.
Represin de la transcripcin
Los represores son protenas que bloquean la sntesis de RNA
en genes especficos.

Ej. represor Lac, la transcripcin de los genes
correspondientes a las enzimas del metabolismo de la lactosa
se bloquea cuando no hay lactosa disponible.
Las clulas eucariticas contienen tres tipos de
RNA polimerasas nucleares
RNA polimerasa I (Pol I): Responsable de la sntesis de un solo tipo
de RNA, el RNA prerribosmico (o pre-rRNA), que contienen el
precursor de los rRNA 18S, 5.8 S y 28 S.


RNA polimerasa II
Su principal funcin es la sntesis de mRNA y de algunos RNA
especializados (parte de los ARN pequeos que participan en el splicing de
ARN en el ncleo).





El DNA se desenrolla en la secuencia de inicio (Inr) y el sitio de inicio de la transcripcin se
encuentra normalmente en o muy cerca de esta secuencia.
Y=pirimidina
Secuencias reguladoras: sirven de sitios de unin de una amplia variedad de protenas que
afectan a la actividad de la Pol II.

Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006

Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
Transcripcin mediada por la RNA polimerasa II

DNA desenrollado en la regin Inr
por la act. helicasa de TFIIH y tal vez
TFIIE, creando el complejo abierto.
Mediante TFIIH,
la polimerasa abandona
el promotor
e inicia la transcripcin
La elongacin est acompaada
por la liberacin de muchos factores de
transcripcin y tambin es potenciada
por factores de elongacin
Durante la sntesis de los
primeros 60-70 nt se liberan
primero el TFIIE y despus el
TFIIH.
Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
El TFIIH no slo participa en la formacin del complejo cerrado de transcripcin
sino que algunas de sus subunidades son tambin componentes esenciales del
complejo autnomo de reparacin por excisin de nucletido.


Cuando la Pol II se detiene en una lesin del DNA, el TFIIH puede interaccionar con
la lesin y reclutar el complejo completo de reparacin por excisin de nt.


La prdida gentica de ciertas subunidades del TFIIH puede producir
enfermedades en humanos, como el xeroderma pigmentosum y el sndrome de
Cockayne, que se caracteriza por retraso del crecimiento, fotosensibilidad y
transtornos neurolgicos.

Transcripcin mediada por la RNA polimerasa II
Formacin del transcrito primario y su modificacin durante
la maduracin del RNAm en una clula eucaritica.
Despus de su sntesis las molculas de RNA son modificadas.

Transcrito primario. Molcula de RNA recin sintetizada.











Estos procesos tienen lugar en el ncleo.

el extremo 3se corta y se le
aaden unos 80 a 250
residuos de A para formar
una cola de poli A.
Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
El corte y empalme puede
suceder antes o despus de
las etapas de corte y
poliadenilacin.
Casquete en 5del RNAm


Funciones del casquete:
Proteger al RNAm de las ribonucleasas. Se une a un
complejo proteico especfico de unin al casquete, que
participa en la unin del RNAm al ribosoma para iniciar
la traduccin.
Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
Intrones del grupo I. Son de autocorte y empalme, no
requieren complejos proteicos. Se encuentran en
algunos genes nucleares, mitocondriales y de
cloroplastos que codifican rRNA, mRNA y tRNA.

Intrones del grupo II. Se encuentran en transcritos
primarios de los RNAm de mitocondrias o
cloroplastos, en hongos, algas y plantas.
Maduracin del RNAm eucaritico.
La cola de poli A en el extremo 3 de los RNAm eucariticos sirve
de sitio de unin de una o ms protenas especficas.

La cola de poli A y sus protenas asociadas protegen
probablemente al RNA de la destruccin enzimtica.
Maduracin del RNAm eucaritico.
Maduracin del RNAm eucaritico.






A-G: intrones
1-7: exones
L: Pptido seal (exportacin de la protena fuera de la clula).
-Se eliminan los intrones

-- Se forma el casquete en el extremo 5

-- Se poliadenila en el extremo 3

Nelson y col., Lenhinger: Principios de Bioquimica , 3ra edicin, Ed. Omega, 2006
MECANISMO DE TRADUCCIN
Codn y
anticodn
Para que se pueda producir la traduccin del total de los 61
codones se requiere un mnimo de 32 RNAt (31 se utilizan para
codificar los aa. y 1 para el inicio).




Cdigo gentico
Ribosomas
Sntesis de protenas

Fases de la traduccin

Fase 1: Las aminoacil RNAt sintetasas unen los aminocidos
correctos a sus RNAt.

Aminoacil RNAt sintetasas

Los 20 aa., son esterificados con sus correspondientes RNAt por las
aminoacil-RNAt sintetasas.

Cada enzima es especfica para un aa. y de uno o ms RNAt.

aa. + RNAt + ATP = aminoacil RNAt + AMP + PPi
Mg
2+

Esta reaccin se lleva a cabo en el sitio activo de la enzima (activacin del
aa. para formar un enlace peptdico).

Fase 2: Sntesis de protenas inicia con metionina
Codn de inicio AUG- Metionina aminoterminal (eucariotas)
N-formilmetionina (procariotas, mitocondrias y cloroplastos)

Secuencias de RNAm que permiten el inicio de la
sntesis proteica en las bacterias

Fase 3: La formacin de los enlaces peptdicos se
llevan a cabo en la fase de elongacin

1
2
3
4
Formacin de enlace
peptdico
Fase 3: La formacin de los enlaces peptdicos se
llevan a cabo en la fase de elongacin









Factores de elongacin: EF-Tu, EF-Ts y EF-G en las bacterias (protenas citoslicas solubles).
Fase 4: Terminacin de sntesis de polipptidos
Codones de terminacin UAA, UAG y UGA


Cuando un codn de terminacin ocupa el sitio A del ribosoma,
tres factores de terminacin o de liberacin (RF-1, 2 y 3)
contribuyen a:

1) La hidrlisis del enlace peptidil RNAt terminal
2) La liberacin del polipptido y del ltimo RNAt del sitio P
(descargado)
3) La disociacin del ribosoma 70s (en sus subunidades 30s y
50s)
Fase 4: Terminacin de sntesis de polipptidos
RF 1. Reconoce UAG y UAA
Procariotas RF 2. Reconoce UGA y UAA
RF 3. Quiz libere la subunidad ribosmica



Eucariotas eRF. Reconoce los tres codones de terminacin