Extraccin y Cuantificacin

de ADN
Tecnologa Bsica
Extraccin y Cuantificacin


Amplificacin: PCR (Polymerase Chain Reaction)


Separacin: Electroforesis

Deteccin


Anlisis

Extraccin de ADN: Mltiples maneras!!
EXTRACCION DE ADN
ORGANICA
CHELEX
PAPEL FTA
OTRAS
Extracciones basadas en estuches
QIAamp, GeneClean, etc.
Pueden depender en
Protocolos de LAB
Tipo de muestra
Preparacin de Muestra
Extraccin de ADN Orgnica

Extraccin por Chelex

Extraccin de ADN utilizando papel
FTA

Estuches QIAamp para separar ADN
Equipo basados en robtica pueden
requerir otros mtodos
EXTRACCION ORGANICA DE ADN
PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL
ALCOHOL (PCI)

PRODUCE ADN DE ALTO PESO
MOLECULAR
CONSUME MUCHO TIEMPO
QUIMICOS PELIGROSOS
MULTIPLES TRANSFENCIAS (posibles
errores)
EXTRACCION ORGANICA DE
ADN
COLOCAR MUESTRA EN EL TUBO

AADA SDS (detergente) Y PROTEINASE K
ROMPE LAS CELULAS (SDS)
ROMPE LAS PROTEINAS (Proteinase K)

AADA FCI => Fenol disuelve protenas y
lpidos
Particiona macromolculas basedo en propiedades
hidrofbicas e hidroflicas
Cloroformo aumenta la densidad de fase del fenol
Alcohol Isoamyl disminuye la espuma
ADN MAS SOLUBLE => EN FASE ACUOSA
RECUPERACION DE ADN
Hay que limpiar; diferentes maneras de hacer esto
EXTRACCION POR CHELEX
1991 Laboratorios Bio-Rad
RESINA QUELANTE
REMUEVE MAGNESIO
(INACTIVA NUCLEASAS DE ADN)
ENLAZA LOS DESPERDICIOS DE LA
CELULA
UTILIZE SOLO CON PCR (cadena
sencilla)
EXTRACCION POR CHELEX
AADA MUESTRA AL TUBO
AADA AGUA Y SOLUCION AL 5% DE
CHELEX
100C PARA ROMPER CELULAS
DESTRUIR PROTEINAS
ADN ES DENATURADO A CADENAS
SENCILLAS
UTILIZE SOBRENADANTE
DIRECTAMENTE EN PCR
EXTRACCION CON PAPEL
FTA
PAPEL ALMACENAJE A BASE DE
CELULOSA
CONTIENE QUIMICOS
PREVIENE ACTIVIDAD DE NUCLEASA E
INHIBE CRECIMIENTO BACTERIANO

ESTABLE A TEMP AMBIENTE POR AOS

UTILIZE PARA MUESTRAS DE SANGRE O
SALIVA DE VICTIMAS O SOSPECHOSOS
Tecnologa FTA

Rompe clulas y membranas de
organelos
-Fsicamente Atrapa Acidos Nucleicos
(ADN & ARN)
Preserva y Proteje Acidos
Nucleicos
-Previene Dao por radicales libres/UV
-Previene Dao Enzimtico
-Inhibe crecimiento de hongos y
bacterias
Provee Seguridad al Usuario
-Inactiva Potenciales Viruses
Peligrosos
Preparacin de ADN Rpida y Eficiente

FTA: Forma de Archivo Costo Efectiva
10 Platos = 240 muestras
Temp de almacenaje = -20
0
C
240 Tarjetas = 240 muestras
Temp de almacenaje = Temp
ambiente
Costo
$2,000/congelador/ao
Costo
$75/gabinete de
archivo
240 Tubos = 240 muestras*
Temp de almacenaje= -20
0
C
Convencional versus FTA
Archivado a Temperatura Ambiente
Perfil de STR de
sangre archivada en
1989 y analizada en
2003
Muestras archivadas en
ambientes diferentes,
selladas en sobre de
aluminio
Proceso normal de
coleccin de muestra
10 L de reacciones de
Profiler aadido a
muestras, 24 ciclos

EXTRACCIN DE PAPEL
FTA
Sangre o saliva seca en papel FTA
Clulas se ROMPEN al contacto
UTILIZE rotera para aadir MUESTRA al
TUBO
LAVE para remover HEME y otros
inhibidores de PCR

Aada roto DIRECTAMENTE a reaccin
de PCR
EXTRACCIN DE PAPEL
FTA
CUANTIFICACIN NO es necesaria
Cantidad de muestra consistente
Resultados consistentes

Posible AUTOMATIZACIN
ORGNICA Papel FTA CHELEX
Mancha
de
sangre
ROTO
LAVAR Mltiples veces
con buffer de extraccin
PREPARAR PCR
Reactivos
de PCR
SDS, DTT, EDTA
y
proteinase K
ENCUBAR (56
o
C)
Phenol,
chloroform,
isoamyl alcohol
CUANTIFICAR
ADN
Aplicar sangre al
papel y dejar que
se seque
Mancha
de
sangre
VORTEX
(NO CUANTIFICACIN)
Agua
ENCUBAR (ambiente)
5%
Chelex
ENCUBAR (100
o
C)
REMOVER sobrenadante
ENCUBAR (56
o
C)
CUANTIFICAR
ADN
PREPARAR PCR
PREPARAR PCR
Centrifugar
Centrifugar
Centrifugar
Centrifugar
REMOVER sobrenadante
TRANSFER aqueous (upper) phase
to new tube
CONCENTRAR muestra
(Centricon/Microcon-100 or ethanol
precipitation)
Centrifugar
TE buffer
Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2
nd
Edition 2005 Elsevier Academic Press
CUANTIFICACIN DE ADN
ESENCIALES PARA ANLISIS POR PCR
MUY POCO ADN CAUSA TOO DECAIMIENTO DE
ALELOS O FLUCTUACIONES ESTOCSTICAS
DEMASIADO ADN CAUSA DATA FUERA DE ESCALA

MTODOS INICIALES NO MUY
SENSITIVOS O ESPECFICOS
ABSORBENCIA A 260 nm
TINCIN CON BROMURO DE ETIDIO
Cuantificacin comparada a marcador estndar
Cuantificacin por "Slot Blot"
Procedimiento Comn
Especfico para primates
Ha sido modificado para utilizar
quimioluminiscencia en vez de radioactivida
Puede detectar cantidades menores que
nanogramos
Puede detectar ADN de cadena doble y
cadena sencilla

CUANTIFICACIN DE ADN
CUANTIFICACIN POR "SLOT
BLOT"
ESPECFICO PARA ADN HUMANO O DE
PRIMATE
D17Z1
RADIOACTIVO
COLORIMTRICO
QUIMIOLUMINISCENTE

CUANTIFICACIN DE ADN
CAPTURAR ADN GENMICO EN
MEMBRANA DE NILN
AADIR PRUEBA D17Z1
INTENSIDAD DE LA MUESTRA
COMPARADA A ESTNDARES
SENSITIVA A ~ 150 pg DE ADN o 50
copias de ADN genmico
Slot Blot
Ventajas Desventajas
Puede ser sensitivo
Reemplaza
radioactividad
Puede detectar
cadenas sencillas y
ADN parcialmente
degradado.
Cantidad dada es
slo de ADN
humano
Consume tiempo
Labor intensiva
20 ng
10 ng
5 ng
2.5 ng
1.25 ng
0.63 ng 20 ng
10 ng
5 ng
2.5 ng
1.25 ng
0.63 ng
Estndares de
Calibracin
Estndares de
Calibracin
Muestras
Desconocidas
~2.5 ng
Figure 3.3, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2
nd
Edition 2005 Elsevier Academic Press
Fluorometra vs
Espectrofotometra
Fluorometra
*Utilizar un fluorocrome como Hoechst 33258 o
PicoGreen
-- aumento en emisin a 458 nm cuando
enlazado a ADN de doble cadena

*Tiene poca afinidad para ADN de cadena sencilla
o ARN
--se enlaza al surco menor, rico en A-T

*Muestra es comparada a curva estndar de ADN
cuya concentracin es conocida
--utilize estndar con composicin similar
para lecturas ms precisas
Cuantificacin de ADN por
espectrofotometra
Concentracin de ADN puede ser determinada
midiendo la absorbancia a 260 nm (A
260
) en un
espectrofotmetro utilizando una cubeta de
cuarzo

Medidas tomadas a una A
260
deben leer entre 0.1 y 1.0.
Una absorbancia de 1 unidad a 260 nm corresponde a
50 g de ADN por ml


A
260
= 1 50 g/ml
Pureza de ADN: Proporcin A
260
/A
280

*Proporcin indica pureza/presencia de
contaminantes que pueden absorber luz UV
(protenas, etc.)

*ADN puro tiene una proporcin de 1.7-2.0
--en buffer ligeramente alcalino, pH 7.5



*Fenol absorbe a 270-275 nm (similar a ADN)
--imita alta pureza y produccin
--aumenta el valor A
260

PCR utilizando 'Real
time'
(qPCR)
Continuar!!