La secuenciacin del exoma identifica

FANCM como un gen susceptible al

cncer de mama triple negativo.
Oct 2014

Kiiski JI, Pelttari LM, Khan S, Freysteinsdottir ES, Reynisdottir I, Hart SN, Shimelis H, Vilske S, Kallioniemi A,
Schleutker J, Leminen A, Btzow R, Blomqvist C, Barkardottir RB, Couch FJ, Aittomki K, Nevanlinna H.

Arreola Rendn Mara Elena

Martnez Chvez Karla Iliana

Mendoza Morquecho Paola
Valencia Norma

Cncer de mama
Cncer ms comn que afecta mujeres en todo el mundo.
Principal causa de muerte en cncer en mujeres, sumando el 14% de muertes por
cncer.
La etiologa del cncer de mama es multifactorial, y el riesgo depende de varios
factores como edad, historia familiar, y factores reproductivos, hormonales y dieta.

La mayora de los cncer de mama son espordicos, pero aproximadamente 15% de

los casos muestran agregacin familiar.

Cncer de mama triple negativo

Falta de expresin a receptores de estrgeno (ER), receptores de
progesterona (PR) y receptor del factor de crecimiento epidrmico
humano 2 (HER2)
Mal pronstico.

Genes susceptibles al cncer

Cncer de mama BRCA1
Cncer de ovario BRCA2
Muchos genes y alelos susceptibles al cncer de mama con diferentes
niveles de riesgo y prevalencia en la poblacin han sido reconocidos.

Portadores de mutaciones en

Protenas codificadas por los

genes BRCA1 y BRCA2
involucradas en la
reparacin de DNA de doble
cadena cuando se rompe
(Recombinacin homloga)

Bsqueda de genes
involucrados en la
reparacin de ADN
implicados en la
susceptibilidad de
cncer de mama

Ruta de Fanconi/
BRCA
La anemia
de Fanconi es un raro
desorden
gentico causado por
una
mutacin biallica en
genes FA que participan
en la reparacin de
ADN.
Por lo menos 15 genes
FA han sido
identificados.

 Pacientes heterocigotos con mutaciones en ciertos genes FA tienen un elevado

riesgo de cncer, mutaciones monoallicas en por lo menos 4 de estos genes
estn asociados con un incremento de riesgo de cx de mama u ovario.
Mutaciones fundadoras en varios genes de susceptibilidad al cncer, incluyendo
BRCA2, PALB2 y RAD51c y genes FA, han sido identificados en la poblacin
finlandesa.
Mutaciones fundadoras en PALB2 y RAD51C han sido detectadas en una
frecuencia del 2% en familias finlandesas con c. de mama y ovario, mientras que
en otras poblaciones, mutaciones en estos genes son raros y a veces nicos en
cada familia.

Materiales y mtodo

Muestras
Secuanciacion del exoma: Se seleccionaron 24 pacientes
mama BRCA1/2 negativos de 11 familias finlandesas

con cncer de

Genotipado de variantes seleccionadas del exoma: 3,166 casos de cncer

mama y 2900 controles (mujeres sanas)
Fase I
524 casos cncer
mama BRCA1/2
negativos

Fase II
552controles

Fase III
1,730 pacientes con cncer
(no seleccionados), 233
pacientes BRCA1/2 negativos
y un total de 1,274 controles

La identificacin de la mutacion sin sentido en FANCM fue genotipada en

series no seleccionadas de pacientes de cncer de mama de Islandia,
incluyendo 92 casos familiares y 873 espordicos.

Secuenciacin del exoma

Se utiliz Agilent SureSelect
Human All Exon Kit 50-Mb para
capturar las regiones del exoma
de 3 g de ADN genmico

Variantes
Se usaron diferentes criterios de filtrado para seleccionar las variantes del
exoma que se secuenciaron para su genotificacin.
Variantes con una media menor a 15 fueron excluidos. .
Variantes comunes (>1% frecuencia) se realizaron usando el Proyecto de
los 1000 genomas, NHLBI Exome Sequencing Project y datos del exoma de
144 muestras de finlandeses sin cncer.

Genotipado
De las 22 variantes seleccionadas
de 21 genes que participan en la
reparacin del DNA, se analizaron
con
el
sistema
Sequenom
MassARRAY,
qPCR
o
secuenciacin Sanger

Degradacin de ARNm
mediada por secuencias
sin sentido
Se utiliz RT-PCR
para alelos
especficos FANCM con extracto
de RNA de clulas linfoblastoides
de portadores heterocigotos.

Anlisis estadstico
Los valores de P fueron calculados con la prueba de Pearson(chi-square)
mediante Fisher ,si el nmero esperado de clulas era cinco o menos.
Para el meta-anlisis, se combinaron las estimaciones de Helsinki y
Tampere con un modelo de efectos fijos mediante el mtodo de la
varianza ponderada inversa.
Para la correccin de mltiples pruebas, se utiliz el mtodo de Bonferroni,
y la heterogeneidad entre ER positivo y para los subgrupos Tn se
determinaron dos muestras mediante la prueba z.
La edad media de FANCM fc.5101C> T portadores de la mutacin y
no portadores se compar con la prueba T de Student.

Resultados

Secuenciacin e Identificacin de las variantes en

el exoma de los candidatos.

1. Lnea germinal de ADN de 24 pacientes BRCA1 y

BRCA2 negativos de 11 familias con cncer de
mama.
2. Tres pacientes con cncer de mama o de
ovario, entre los familiares de primer y segundo
grado.
3. Se identificaron un total de 80.918 variantes en
80.867 posiciones no sinnimas.

Se utilizo :
Annovar (programa bioinformtico) para anotar las
variantes.
Integrative Genomics Viewer : se analiz protenas
truncadas (variaciones sin sentido, insercin o
deleccin del marco de lectura y sitios de
empalmamiento-splice site)
RikuRator, herramienta para eliminar
artefactos.

posibles

 Slo variantes que se predicen que sean patgenas se

incluyen en el estudio.
La mayora de los genes de predisposicin involucrados con
el cncer de mama estn involucrados en la reparacin de
ADN de doble cadena.

Total de 22 de variantes en 21 genes de reparacin de DNA:

-

20 variantes de un solo nucletido (SNVs)

2 indel--Secuencias Sanger
+ Endonucleasa NEIL1 c.314dupC
+ Helicasa SHPRH c.3577_3580delCTTA

Cosegregacin con el cncer en las familias:

-Deleccin en SHPRH
-Mutacin DNA glicosilasa codificada por el gen MPG.
- ATPase--- RUVBL1 de sentido errneo.
Protena de interaccin 1 PAX (PAXIP1), aumenta la posibilidad
de encontrarlo en las madres finlandesas

Genotipificacin de la poblacin (casos

y controles) FASE I:
Genotipificado 524
-411 con cncer de mama
-113 con cncer de mama y de ovario
SNVs mediante Sequenom MassARRAY system
usando iPLEX Gold assays
PAXIP1 c.803C>T y de NEIL1 c.314dupC con TaqMan
PCR de tiempo real.
SHPRH c.3577_3580delCTTA mediante secuenciacin
Sanger.

FASE II, GENOTIPIFICACIN:

TaqMan PCR tiempo real ,control de (n =552):
*BRCA1 (BARD1) c.2282G>A
Fre.1.8% controles y 2.2% casos.
*PAXIP1 c.803C>T
Fre. de 0.5% controles y 1.2% casos.
*Variante NEIL1 c.314dupC
Un control tipificado de la fase 3.

FASE III:
1730 N/S, 233 fam. (BRCA1 /2 negativos.)
1274 Ctr., 570 N/S de CO.
Los SNV`s en CO (n = 569) a partir de la regin de Helsink.
NEIL1 c.314dupC ---TaqMan PCR tiempo real.
FANCA c.4228T>G--- no se observo en ningn paciente genotipificado de
fase 3
FANCM c.5101C>T anlisis estadstico
RUVBL1 c.950G>A y MPG c.401G>T, adicionalmente en cncer de seno y
de ovario
SLX4 c.2484G>C, FANCM c.5101C>T, y NEIL1c.314dupC ms de 10

FANCM c.5101C> T Asociado con el riesgo de cncer de seno.

Para poder estudiar la segregacin

familiar de FANCM c.5101C>T, 45
individuos
de
ocho
familias
portadoras
de
mutacin
se
genotiparon.
Entre 11 mujeres de la familia con
cncer de mama, cinco llevaron el
FANCM mutacin c.5101C> T.
Entre 16 mujeres de la familia sanas,
siete eran portadoras de la mutacin
(de edades comprendidas entre 33 y
80 aos).
La mayor parte de las familias
mostraron segregacin incompleta
de la mutacin pero en una de las
familias portadoras, las tres hermanas
afectadas con cncer de mama
eran portadoras de la mutacin.
Entre los parientes sin muestras de
ADN disponibles, varios otros tipos de
cncer, adems de cncer de
mama y de ovario estuvieron tambin
presentes, incluyendo el de prstata,
de pncreas, piel, pulmn, mdula
sea, hgado y el cncer de rin.

Discusin de resultados

Poblacin finlandesa

Cncer de mama
Identificacin de alelos asociados
Identificacin de genes de susceptibilidad a cncer de ovario

22 variantes

Secuenciacin
previa

Grandes conjuntos
de datos de
pacientes

Poblaciones
control

Casos de cncer
de ovario.

Mutacin sin sentido de

la FANCM

c.5101C>T

96 pacientes cncer
mama

Histopatologa:
F de ER negativo que
positivo

Estos
hallazgos
sugieren que FANCM=
gen de susceptibilidad
al cncer de mama,
las
mutaciones
confiere una fuerte
predisposicin
para
TNBC

12 pacientes cncer de
ovario

Pacientes con Triple-Negative

Breast Cancer (TNBC) <ORs=2.774.13>
15% casos de TNBC: BRCA1 y BRCA2
70% de los tumores de mama con caractersticas
TN: BRCA1

En la poblacin finlandesa, el alelo

CHEK2 c.1100 de riesgo moderado se
observa con una frecuencia del
control de poblacin similar a la
mutacin FANCM en el conjunto de
datos de Helsinki, pero con una F
entre los pacientes con cncer de
mama
familiar
(5,5%),
con
aproximadamente
cuatro
veces
elevado riesgo

El riesgo de cncer de mama para los

portadores
de
mutaciones
que
truncan CHEK2 se calcula que va del
20% para una mujer con ningn
familiar afectado al 44% para una
mujer con un primer y un segundo
grado afectado

Esto es comparable a la mutacin

FANCM entre los pacientes TN y
especficamente los pacientes TNBC
con antecedentes familiares de
cncer de seno.

Curiosamente, el cambio de
sentido CHEK2 I157T es un alelo de
menor riesgo sin embargo se
asocia especficamente a mayor
riesgo de cncer de mama
lobular
(aproximadamente
4
veces)

FANCM
Protena mas
conservada dentro de la
via FA.
Actividad de
translocasa y
endonucleasa
(estructuras de
reparacin de ADN)

Funcin principal:
respuesta ante
dao a DNA
durante la
replicacin.

c.5101C>T truncamiento de
la protena FANCM, ubicada en
el exn 20

Consistentes

Deficientes de FANCM

Las mutaciones de sentido errneo en

homocigotos FANCM (c.5164C>T, p.P1722S) se
han encontrado en los tumores de mama, y
cuatro SNPs FANCM diferentes se han
asociado con el riesgo de osteosarcoma.
La
mutacin
sin
sentido
c.5791C>T,
(p.Arg1931Ter) ha sido identificada en
pacientes con cncer de colon.

Cncer

CONCLUSIONES
La mutacin sin sentido de la FANCM esta asociada a riesgo a cancer de
mama en la poblacin finlandesa.
La F de la mutacin y fuerte asociacin a riesgo de cncer de mama fue
observado en pacientes con TNBC, implicaciones futuras con el DNA de
reparacin en la etiologa.
El descubrimiento de la variante c.5101C> T en FANCM es esencial para la
evaluacin del riesgo de cncer de mama y el diagnstico precoz.