SEMINARIO N 2

TIPIFICACIN DE LOS ANTGENOS

LEUCOCITARIOS HUMANOS

Mayma Aguirre Kevin Jess

TCNICAS MOLECULARES DE
TIPIFICACIN DEL HLA: PCR-SSP,
PCR-SSOP Y PCR-SBT.
FUNDAMENTO, ETAPAS, VENTAJAS Y
DESVENTAJAS.

PCR

 Las tcnicas de tipicacin molecular HLA se

han diversicado, utilizando mtodos que
emplean un paso previo de amplicacin PCR.
Los ms utilizados son:

 a) PCR-SSP (primers o cebadores especficos

de secuencia), que consiste en la amplificacin
con SSPs, que slo amplifican las muestras en
las que los primers o cebadores reconozcan el
alelo para el que son especficos.

Micro

TM
SSP

1. Agregar Amplitaq de PerkinElmer y la muestra de DNA

en el tubo de D-Mix

Procedimiento
2. Agregar 10 ul de la
solucion que contiene el
DNA/mezcla-D a cada
uno de los pozos de la
micro-placa del SSP, con
excepcin del pocillos
que es el control
negativo.
4. Transferir
el producto
de la
reaccin de
PCR en un
gel.

3. Termociclador (Perkin Elmer 9600)

Micro SSPTM Procedimiento

1
2
3
4

5. Correr la electroforesis.
6. Analizar los
patrones de bandeo
y asignar los alelos
correspondientes.

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7. Interpretacin

Ventajas
Tcnica sencilla que requiere poco
equipamiento sofisticado
No requiere el aislamiento de clulas
Resolucin mayor que las tcnicas serolgicas
Costo relativamente bajo
Permite la deteccin de alelos "nulos"

Desventajas
Ambigedades
Cada par de "primers" permite amplificar uno
o unos pocos alelos del HLA, ser necesario el
empleo de un gran nmero de pares de
"primers" con el fin de obtener una resolucin
aceptable.
El mtodo no resulta prctico para anlisis
simultneo de un gran nmero de muestras.
No se detecta homocigosis.

 b) PCR-SSOP (oligonucletidos o sondas

especficas de secuencia) que consiste en la
amplificacin por PCR de los distintos exones
polimrficos de los genes HLA (exn 2 en los
genes HLA-DR, -DQ y -DP; y exones 2 y 3 en
HLA-A, -B y -C) y su hibridacin posterior con
SSOs.

Ventajas

No requiere el aislamiento de clulas

Alta resolucin
Es posible detectar homocigosis
Se puede realizar la deteccin por
quimioluminiscencia, por lo que no se generan
desechos radiactivos
Permite la deteccin de alelos "nulos"
Permite el anlisis simultneo de un nmero
grande de muestras

Desventajas
Reactividad cruzada entre sondas, deteccin de
determinadas combinaciones de alelos producen
patrones similares en las placas de
autorradiografa
Las condiciones de lavado de las diferentes
sondas pueden ser diferentes, lo que complica en
procesamiento simultneo de muchas muestras
A pesar de su elevada resolucin, siguen
existiendo ambigedades
Generacin de desechos radiactivos

 c) PCR-SBT (Tipaje Basado en la

Secuenciacin), consiste en la amplificacin y
secuenciacin de los exones polimrficos de
los genes HLA.

Ventajas
No requiere el aislamiento de clulas
Alta resolucin (se alcanza el mximo de
resolucin posible)
Se puede interrumpir la tcnica en diversos pasos
Ideal para la deteccin de homocigosis
ptimo para tipificacin de donantes cadavricos
Interpretacin automatizada
Permite la deteccin de alelos "nulos"

Desventajas
Tcnica sofisticada que requiere equipamiento
complejo y altamente costoso (secuenciador
automtico de ADN)
Elevado costo (todava)
Se puede analizar un nmero reducido de
muestras simultneamente (dependiendo
esto del tipo de detector que posee el
secuenciador)