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Mtodos eficaces y

flexibles para visualizar y


cuantificar hongos
micorrcicos.
SUSAN G. W. KAMINSKYJ
Department of Biology, University of
Saskatchewan, 112 Science Place, Saskatoon SK,
Canada, S7N 5E2

Resumen.
Los hongos asociados a las races de las plantas estn ganando
protagonismo en cuanto a su importancia para la supervivencia
de las plantas en una diversidad de los ecosistemas terrestres. La
evaluacin de la importancia de los tipos de interaccin
depende en parte de la cuantificacin de la interaccin
prevalente, sobre todo en las plantas cosechadas de los
ecosistemas naturales. A su vez, esto depende de un mtodo
sensible para la visualizacin de hongos, y un mtodo fiable
para
cuantificar
potencialmente
mltiples
morfotipos
ectomicorrcicos. Se discuten los desarrollos recientes en estas
reas.

Introduccin

Las Races de las plantas


se asocian con una
diversidad
de
endomicorrizas y hongos
de la rizosfera cuyas
interacciones variar de
endofias a patgenas.
Con el fin de estudiar la
naturaleza
de
las
interacciones
de
las
infecciones fngicas de
plantas y su importancia
relativa para las plantas,
es esencial que visualizar
los hongos claramente y
cuantificarlos
con
precisin.

Materiales
Eleccin del marcador
Merryweather y fitter (1991) utilizan lacto fucsina para imgenes
fluorescentes, pero este mtodo no haba sido reportado por los
autores u otros. Se consideraron independientemente fucsina lacto
como un marcador fluorescente de clulas de hongos dentro de
races de las plantas, en particular mediante microscopa confocal
de epifluorescencia.
las races claras suelen teirse
con chlorazole black E (CBE)
(Brundrett et al., 1996), azul de
tripano (Phillips y Hayman,
1970),
o
lactofuchsin
(Carmichael,
1955).
Estos
ltimos a veces tienen un
contraste insuficiente para
alta magnificacin de luz
microscopa transmitida.

la mayor cantidad de suelo se


retir suavemente con la mano.

Las muestras de raz se colocan


en autoclave durante 20
minutos en 10% de KOH

se retiro el suelo restante por


remojo y luego se enjuaga en
agua del grifo.

Posteriormente las
muestras se cubren
con papel aluminio

se fijaran las races en formaldehdo


al 3,7% que contiene etanol 0,5%,
regulado a pH 7 La fijacin con solo
formaldehdo al 3,7%, y con etanol al
70% o al 95% tambin fue probado.

se deben cortar en segmentos de 1-2


cm de largo, suspendido en un gran
volumen de agua, y luego submuestrear al azar.

Para Aclarar las muestras


deben enjuagarse dos veces
a temperatura ambiente en
70% de etanol para eliminar
el KOH.

Se blanquea en una solucin de


perxido recin preparado o con
un blanqueador comercial de
hipoclorito de sodio diluido en
agua destilada a aproximadamente
1,75% NaClO 3

Colocar las races en porta objetos . es ms


conveniente montar las races paralelas a lo
largo del eje del portaobjetos

Las races se tien en


lactofuchsin 0,1% fucsina cida
en cido lctico al 85%. La
tincin es de 0,5-3 horas a 47
C - 68 C

Colocar las races en solucin PVAG (4 g de


polvo de alcohol polivinlico : agua destilada
50 ml: 20 ml de glicerol. Esto se calent a 60
C (cubierta) con agitacin constante hasta que
se disolvi, 3 h durante la noche.

Imagen

Fig. 3. El procedimiento de escaneo para el mtodo de cuantificacin mltiple.


Races (A) se visualizaron utilizando al menos 200X ampliacin (B). Estructuras
fngicas que se cruzan la lnea vertical de la retcula se consideran, a lo largo de
toda la profundidad focal de la raz. (C) Las intersecciones se espacian
uniformemente moviendo la etapa por un campo de vista cada determinado
tiempo.

Fig. 4. colonizacin de micorrizas arbusculares en Taraxacum officinale (diente de


len comn). Esta muestra se ti con lactofuchsin y se fotografi con luz
transmitida (A) y la ptica de epifluorescencia confocal (B). Arbsculo (Ar). La
flecha indica la continuidad entre una hifa intercelulares y el arbsculo.

Mtodo de cuantificacin
mltiple
Con la tcnica de MQM, cada tipo de morfologa de hongos
se marca por separado, y las nuevas categoras se pueden
agregar si es necesario. En las muestras que contienen
mltiples tipos de hongo endfito. puede facilitarse teniendo
en cuenta la morfologa de las hifas a cada lado de la
interseccin (ya que son propensos a ser continuo), pero los
datos de cuantificacin slo debe ser recogidos en la
interseccin. Adems de marcar interacciones de hongos, la
ausencia de interaccin tambin es importante.. De lo
contrario, como en Allen et al. (2006), la abundancia de suma
podra ser engaosa.
En Ormsby et al. (2007) nos enfrentamos con el reto que
algunas intersecciones tenan slo 01 MA hifa, mientras que
en otros eran muy abundantes. Definimos categoras
adicionales (en este caso de baja, media y alta abundancia
de hifas) para describir esta variacin (Cuadro 1, Ryan et al.
(2003) han demostrado que la MA hifas intercelulares tambin
puede participar en la transferencia de nutrientes minerales.

Discusin
Hasta la fecha, para las muestras recolectadas de sitios de
campo, la tincin con lactofuchsin visto con epifluorescencia
ofrece una combinacin conveniente de relativa sencillez de la
preparacin y la calidad de imagen.
La eleccin de imgenes de fluorescencia confocal vs widefield
depende de la necesidad, y, naturalmente, de la disponibilidad
de los equipos.
La ptica de epifluorescencia Confocal son a menudo superiores
para la documentacin, mientras que la ptica de campo amplio
es ms eficiente para la cuantificacin.
Hemos encontrado que la cuantificacin endomicorricica
utilizando el mtodo de MQM es reproducible, as como flexible.
MQM es muy adecuado para races de las plantas cosechadas a
partir de lugares naturales donde los hongos endomicorricicos no
estn necesariamente bien descritos. Por otra parte, MQM puede
cuantificar la contribucin relativa de las diferentes interacciones
endomicorricicas, que intrnsecamente debe estar relacionado
con su importancia para la fisiologa de la planta.