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PRUEBAS DE

RESISTENCIA
BACTERIANA

BUSQUEDA Y
CONFIRMACION
GLORIA D. PACHECO S.
Especialista de Producto BD Diagnostics
gloria_pacheco@bd.com
Cel: 315-7920177

BACILOS GRAM
NEGATIVOS

BGN

ESBLs
-Lactamasas de Espectro
Extendido

Inicialmente se encontraron:

Tambin se encuentran en:

Klebsiella, E. coli
Proteus, Serratia
Enterobacter, Salmonella
Morganella, etc.

Son inhibidas por el cido Clavulanico y


Tazobactam (menos por Sulbactam).

ESBLs
-Lactamasas de Espectro
Extendido

Principales Familias de ESBLs

TEM-3, 4 . 137
SHV-2, 3 . 54
CTX-M-1, 2 37
Otras Familias y ESBLs individuales

Por qu la Prueba de Lactamasas?

Terapia Correcta

Los puntos de corte no detectan con


seguridad nuevas -Lactamasas

Control de la Infeccin

Identificar las Drogas que causan


Resistencia

DETECCION DE ESBLs
DOS ENFOQUES

Pruebas de Screening y Pruebas


Confirmatorias para Screen Positivos

Pruebas Confirmatorias

DETECCION DE ESBLs
PRUEBAS DE SCREENING

Ventajas:

Menos Trabajo
Econmica

Desventajas:

Sensibilidad < 100%


Demoran la Confirmacin
Se deben reportar Screen positivos?

PRUEBA CONFIRMATORIA CLSI


Klebsiella, E. coli y P. mirabilis

Prueba MIC:

Cefotaxime y Ceftazidime +/- 4 g/ml Clavulanato:


Disminucin de > 3 doble diluciones de cualquiera
de los dos antibiticos.
e.j.: Cefotaxime
8 g/ml
Cefotaxime + Clavulanato
1 g/ml

Prueba de Disco:

Cefotaxime y Ceftazidime +/- 10 g Clavulanato


Incremento en el halo de inhibicin de > 5 mm.

Mtodo de Disco

Mtodo de Doble Disco

CLSI RECOMENDACIONES
EL REPORTE

Confirmar ESBLs: E. coli, Klebsiella, P. mirabilis

Reportar Resistente:
Todas las Penicilinas
Cefalosporinas
Aztreonam
Independiente del resultado in vitro
Excepto Cefamicinas (e.j.: Cefoxitina,
Cefotetan)

ESBLs en microorganismos diferentes


de:
Klebsiella, E. coli y P. mirabilis

La mayora de Laboratorios no intentan


detectar ESBLs en microorganismos diferentes
de E. coli y Klebsiella
Dos indicaciones para la prueba de ESBLs en
otros microorganismos:

ESBLs detectada en Klebsiella, E. coli y P. mirabilis


Fenotipo sospechoso

Cual prueba?

Usar una prueba especifica (confirmatoria)

DIFICULTADES EN LA PRUEBA
DE ESBLs
EFECTO DEL INOCULO
MICs en g/ml: SHV-3 producida por
Citrobacter freundii
Inocul.
CFU/ml

Cefotaxime

Ceftazidime

Aztreonam

Cefepime

5 x 105

0.5

0.5

(CLSI breakpoint 8 g/ml)

DIFICULTADES EN LA PRUEBA
DE ESBLs
EFECTO DEL INOCULO
MICs en g/ml: SHV-3 producida por
Citrobacter freundii
Inocul.
CFU/ml

5x
105
5x
107

Cefotaxime

Ceftazidime

Aztreonam

Cefepime

0.5

0.5

256

32

32

>1024

(CLSI breakpoint 8
g/ml)

DIFICULTADES EN LA
PRUEBA DE ESBLs
Recomendacin

(no Aprobadas por


CLSI): Extender la recomendacin de
reporte del CLSI a todos los
microorganismos productores de ESBLs
Reportar todos microorganismos
productores de ESBLs por la misma va:
resistente a todas las Penicilinas,
Cefalosporinas y Aztreonam

DIFICULTADES LA PRUEBA
DE ESBLs
Alto

nivel de expresin of AmpC puede impedir


el reconocimiento de una ESBLs
Problema in especies que producen lactamasa AmpC inducible codificada
cromosmicamente (e.j. Enterobacter,
Serratia, Providencia, etc.)
Problema en E. coli y K. pneumoniae que
adquiere plasmidos de AmpC
Clavulanato puede actuar como un inductor de
alto nivel de AmpC e incrementar resistencia a
las drogas de screening dando falsos
negativos en la prueba confirmatoria - ESBL

-Lactamasa AmpC
Cefalosporinasa
Hidroliza todos los antibiticos -lactmicos

excepto Carbapenems y Cefepime


No son Inhibidos por Clavulanato y Sulbactam
Algunas son inducibles
Caractersticas de ciertos gneros:

S
P
A
C
E

Serratia
Providencia/P. aeruginosa
Aeromonas
Citrobacter freundii
Enterobacter, Hafnia

AmpCs Mediada por


Plsmidos
Klebsiella,

E. coli, Salmonella, P. mirabilis


Muchas enzimas, algunas son inducibles
Prevalencia es baja pero se esta
incrementando
Aprox. 1/3 de laboratorios U.S.
3.3 8.5% K. pneumoniae en USA

DIFICULTADES EN LA PRUEBA
DE ESBLs
Abordaje

en la deteccin ESBL en
cepas productoras de AmpC

Uso Tazobactam o Sulbactam en lugar de


Clavulanato en Prueba Confirmatoria ESBL
porque hay menos probabilidad de inducir
produccin AmpC
Incluir Cefepime como antibitico de screening
porque a alto nivel de expresin de AmpC tiene
un efecto mnimo en la actividad de Cefepime
Incluir Cefamicinas (Cefoxitina) como antibitico
de screening porque las Cefamicinas son
hidrolizadas por AmpCs pero no por ESBLs

Diferencias entre Lactamasas


ESBLs y AmpC

Resultados Prueba

ESBL

AmpC

Inhibida Clavulanato

Si

No

Hidroliza:
-Cefalosporinas

Si (R)

Si (R)

-Cefamicinas
-Cefepime

No (S)
Si (R)

Si (R)
No (S)

Cuando Sospechar AmpC


Plasmdica

Prueba de Disco para -lactamasa AmpC debe ser


realizada en aislamientos de E. coli, Klebsiella spp,
P. mirabilis, Salmonella positivos en alguno de los
siguientes screens:

Cefoxitina-no susceptible (i.e. I o R)

Screen ESBL - positivo pero prueba confirmatoria ESBL es


negativa

Ceftazidima y Cefoxitina I o R (e.j. MIC > 16 g/ml para


ambas drogas) y prueba confirmatoria ESBL negativa
(este Screen puede tener buena especificidad)

Como determinar si ambas:


AmpC y ESBL estn
presentes
Prueba

Disco

de Difusin de Doble

Mirar el tipo de patrn AmpC ms


el efecto del cido Clavulanico

E. coli con AmpC mediada


por plasmidos

Cultivo :
E. coli ATCC 25922

Microorganismo a Ensayar
en disco

Prueba de Disco - AmpC

S. marcescens con AmpC


Cromosomal y ESBL

Bush Group 1 o AmpC


-Lactamasas Inducibles
Recomendaciones para el Laboratorio

Los Laboratorios deben marcar todos organismos

conocidos que poseen -lactamasas inducibles (S/IB)


Ejemplo de Pie de nota:
Este microorganismo se conoce que poseen lactamasas
inducibles. Estos aislamientos pueden
desarrollar resistencia a todas las cefalosporinas
despus de iniciar la terapia. Evitar el uso de antibioticos
-lactamicos.

AmpC Cromosomal que no


Expresa Alto Nivel de
Resistencia
Cto. de: Enterobacter cloacae Este
microorganismo se conoce que posee -lactamasas
inducibles. Los aislamientos puede comenzar a
presentar resistencia a todas las Cefalosporinas
despus de iniciar la terapia. Evitar el uso de
antibiticos -lactamicos.

Amikacina S
Ampicilina R
Cefazolina R
Ceftazidima
Cefepime S
Ceftriaxona S
Gentamicina
Levofloxacina

S
S

AmpC Cromosomal que si


Expresa Alto Nivel Resistencia

Cto. de: Enterobacter cloacae - Este


microorganismo se conoce que posee lactamasas inducibles. Los aislamientos puede
comenzar a presentar resistencia a todas las
Cefalosporinas despus de iniciar la terapia.
Evitar el uso de antibiticos -lactamicos.

Amikacina S
Ampicilina R
Cefazolina R
Ceftazidima
Cefepime S
Ceftriaxona R
Gentamicina
Levofloxacina

S
S

AmpC Cromosomal que si


Expresa Alto Nivel Resistencia

Growth of: Enterobacter cloacae

Amikacina S
Ampicilina R
Cefazolina R
Ceftazidima
Cefepime S
Ceftriaxona
Gentamicina
Levofloxacina

R
R
S
S

AmpC Cromosomal que es


Sospechosa de ESBLs

Growth of: Enterobacter cloacae

Amikacina S
Ampicillin R
Cefazolin R
Ceftazidime
Cefepime S
Ceftriaxone
Gentamicin
Levofloxacin

I
S
S
S

E. cloacae con AmpC


Cromosomal y ESBL

AmpC Cromosomal que es


Sospechosa de ESBL

Cto. de: Enterobacter cloacae Este


microorganismo posee una ESBL. Se
rquiere Aislamiento de Contacto.

Amikacina S
Cefazolin R
Ampicillin R
Ceftazidime
Cefepime R
Ceftriaxone
Gentamicin
Levofloxacin

R
R
S
S

K. pneumoniae con ESBL, AmpC y


Carbapenemasa

Resistencia a
Carbapenems
Microorganismos

intrnsicamente
menos susceptibles Acinetobacter
spp., P. aeruginosa
Alta AmpC + permeabilidad reducida
Clase A carbapenemasas (KPC,)
Clase B metalo--lactamasas (IMP,)

COCOS GRAM
POSITIVOS

CGP

Staphylococcus aureus
Meticilina Resistente
(MRSA)

Incidencia incrementando en
hospitales especialmente en ICU o en
pacientes con quimioterapia
Estn comenzando a aparecer cepas
Vancomicina Intermedia y Resistente
Esta Emergiendo MRSA adquirido en
la comunidad (CA-MRSA) que aparece
susceptible a muchos agentes orales

El nuevo Staphylococcus
aureus Meticilino
Resistente Adquirido en
la Comunidad
CA-MRSA

Propiedades Distintivas CAMRSA


Resistente

solamente a Meticilina
con Resistencia cruzada solamente a
otros -lactamicos
Asoc. con Sndromes semejando a los
causados por MSSA
Puede causar Infecciones Serias
(fatales)
Mongkolrattanothai K et al. CID 37:1050, 2003
Hiramatsu K, Daum
R: ICCAC (48) CA-MRSA: A Worldwide Reality?,
2003

Propiedades del CAMSusceptibles


RSA a mas antibiticos que HA-MRSA

SCCmec IV o V (raramente que el I-III)


Pequeos
Mas mvil
Muchos aislamientos expresan Panton-Valentine
Leukocidin (PVL)
Potente toxina asociada con furunculosis
No se conocen factores de riesgo en personal de
cuidado de la salud
Es mas comn las Infecciones de Piel y Tejidos
blandos, ocasionalmente neumona necrotizante

Manifestaciones CAMRSA

Neumona Necrotizante
Osteomielitis
Abscesos
Empiema
Fascitis Necrotizante
Tromboflebitis Sptica
Sepsis Severa

CA-MRSA Opciones de
Tratamiento
Clindamicina

- Oral es el agente que se ha


redescubierto para Infecciones por CA-MRSA

CA-MRSA

la prueba es usualmente susceptible


a Clindamicina

El

problema es cuando el microorganismos


tiene una prueba de susceptibilidad:
Eritromicina-R y Clindamicina-S

Algunas

cepas pueden tener Resistencia


Inducible

Staphylococcus spp.
Eritromicina /
Clindamicina
Mecanismo

Eflujo
Alteracin
Ribosomal
Alteracin
Ribosomal

Determina
nte

Eritro

Clinda

msr A
erm

S*

erm

R
constitutiv
a

msrA
= Resistencia a Macrlidos y Streptogramina
erm
= Eritromicin-metilasa ribosomal
* Exige Induccin para mostrar la resistencia

Staphylococcus
aureus
Clindamicina

Eritromicina

Oxacilina

Penicilina

Vancomicina

Si Clindamicina - S y Eritromicina - R, No se debe


reportar Clindamicina - S sin realizar el Test D

Estrategia Opcional de
Informe

Staphylococcus aureus
Eritromicina

Oxacilina

Penicilina

Vancomicina

Contactar al Laboratorio si se necesita


el resultado de Clindamicina

Test D Reaccin
Positiva
Resistencia Inducible
a Clindamicina
(mediada-erm)
Antibiograma por Difusin
de Disco:
Colocar discos de 2 g
Clindamicina y 15 g
Eritromicina a una
distancia de borde a
borde de 15 mm a 26 mm.

15 - 26 mm

Test D Positivo Comentario opcional


Staphylococcus aureus
Clindamicina
Eritromicina
Oxacilina
Penicilina
Vancomicina

R
R
R
R
S

Este S. aureus se presume ser resistente, basado en la


deteccin de Resistencia Inducible a Clindamicina .

Test D Reaccin
Negativa
NO hay Induccin
(Resistencia a
Eritromicina:
Mediada por gen
msrA)

Test D Negativo Comentario opcional


Staphylococcus
aureus
Clindamicina
Eritromicina
Oxacilina
Penicilina
Vancomicina

S
R
R
R
S

Este S. aureus NO demuestra Resistencia


Inducible in vitro a Clindamicina.

Problemas con la
Deteccin de MRSA en el
Laboratorio
Sistemas

Automatizados no siempre son confiables


Se recomienda la placa de Oxacilina Screening para
realizar en todos los Staphylococcus aureus
identificados en Sistemas Automatizados
Mtodo de Difusin de Disco pueden aparecer
como susceptibles (zona de inhibicin alrededor del
disco de Oxacilina)

Se debe examinar muy bien para estar seguros de que no


hay crecimiento de colonias pequeas o un crecimiento
tenue dentro del halo de inhibicin.

Mtodos Recomendados
para la Deteccin de
MRSA
Realizar

pruebas de mecA o PBP 2a,


refiere discrepancias (costosas,
tcnicamente difcil)
Realizar Prueba modificada de disco
de Cefoxitina (2004)

Staphylococcus spp. Oxacilina


MIC (g/ml):

R
S. aureus
CoNS
DD (mm):

2
0.25
-

S. aureus
13
M100-S17(M2, M7); Table 2C
CoNS
18

4
0.5

10

11-12

17

RESISTENCIA A
OXACILINA

STAPHYLOCOCCUS
AUREUS

Mtodo: Oxacillin Screen Agar


Agar Mueller Hinton con 4% de NaCl y
6g/ml de Oxacilina.
Suspensin bacteriana 0.5 McFarland,
de esta dilucin se toma 10 l para
sembrar sobre el agar.
No se recomienda para Estafilococos
Coagulasa Negativa.

Staphylococcus
spp.

Los resultados de la Prueba de


Difusin de Disco con Cefoxitina de 30
g debe ser usados para predecir la
Resistencia mediada por gen mecA
en Staphylococcus.
M100-S17(M2, M7); Table 2C

Disco de Cefoxitina Deteccin


de gen mecA - Staphylococcus
spp.
Mecanismo de R a
S.
Oxacilina
aureus
Produccin de PBP
+
2a (gen mecA)

SCoN
+

Hiperproducin de
Beta-Lactamasa

Alteracin de PBPs
preexistentes

Screen - Difusin de Disco para


Resistencia
mediada por gen mecA en
Staphylococcus:

Reemplazar disco de Oxacilina por disco de


Cefoxitina
Realizar Mtodo Estndar de Difusin de
Disco con disco de Cefoxitina (30 g).
Incubar por 24 h. Los resultados pueden
ser reportados despus de 18 h, si son
resistentes.
Reportar el resultado para OXACILINA, no
para Cefoxitina.

Screen Dilucin (MIC) para


Resistencia
mediada por gen mecA en

Staphylococcus:

: puntos de
ContinuarStaphylococcus
usando Oxacilina y sus
corte:

S. aureus (S 2 y R 4)

SCoN (S 0.25 y R 0.5)

En SCoN de Infecciones severas:

Si MIC =0.5 2 g/mL Realizar prueba por


difusion con Disco Cefoxitina (30 g), si la
cepa es sensible a Cefoxitina informar el
resultado como S a OXACILINA, no para
Cefoxitina.

Screen - Difusin de Disco para Resistencia


mediada por gen mecA en Staphylococcus:
Cefoxitina zona (mm)
S. aureus

21*

22**

S. lugdunensis
CoNS

24*

25**

Reportar como Oxacilina resistente

**

Reportar como Oxacilina Susceptible

CoNS: Estafilococos Coagulasa Negativa


M100-S17 (M2, M7); Table 2C

Reporte de Resultados del MIC Oxacilina Estafilococos CoagulasaNegativa *


MIC Oxacilina (g/ml)

0.5 - 2

>=4

Reportar
Oxacilina Susceptible

Realizar
Prueba mecA o PBP 2a

Reportar
Oxacilina Resistente

Negativa

Positiva

Reportar
Oxacilina Susceptible

Reportar
Oxacilina Resistente

*Probar con cepas diferentes de S. epidermidis de sitios estriles

Reporte de Resultados DD Oxacilina


Estafilococos CoagulasaNegativa *
Oxacilina zona (mm)

<=17

Reportar
Oxacilina Susceptible

Realizar
La Prueba mecA o PBP 2a
Negativa

Positiva

Reportar
Oxacilina Susceptible

Reportar
Oxacilina Resistente

* Probar con cepas diferentes de S. epidermidis de sitios estriles

El Problema - Crtico

Vancomicina sigue siendo una droga


importante por no slo tratar
Infecciones por Staphylococcus aureus,
Staphylococcus Coagulasa-negativa,
Neumococos, y una variedad de otros
organismos Gram Positivos.
Es muy importante descubrir la
Resistencia Emergente a Vancomicina.

Criterios de Interpretacin de la
CLSI Vancomicina y
Staphylococcus spp.
VISA

Criterio 2006

<2

ND= no definido

4-8

VRSA

>16

VISA Fenotipo vs. VRSA


Genotipo

Las cepas VISA representan un fenotipo que


probablemente resulta de mutaciones en varias vas
genticas, que bajo larga presin con Vancomicina
produce:
Paredes celulares alteradas,

Cambios en las vas metablicas,

Lento crecimiento.

En las cepas VRSA hay un cambio en el genotipo donde


las cepas adquieren el gen de resistencia vanA,
muestra una pequea perdida de amplitud, y pueden
transferir la resistencia de Vancomicina a otros
organismos

Caractersticas de la
Pared Celular VISA

QC

MICH

NJ

JAPAN

232,000 x Magnificacin

VISA en Agar Sangre


Mltiples Tipos de
Colonias

Colonias grandes, Colonias pequeas, que


crecen lentamente,
son todas S. aureus mostrando el fenotipo VISA

Patrn de Crecimiento de
VISA
Tiras de Etest de
Vancomicina
Crecimiento al final
de la Elipse

Vanco
MIC
(g/ml)

QC
1.5

MICH
8

NJ
8

JAPAN
8

Resistencia a Vancomicina
Enterococcus spp.

Fenotipos ms comunes:
Resistencia Adquirida
Van A: Fenotipo de alto nivel de resistencia a Vancomicina y
Teicoplanina.
Van B:Bajo a alto nivel de resistencia solo a Vancomicina.
Resistencia Intrnseca
Van C:
Fenotipo asociado a bajo nivel de
resistencia a Vancomicina.

Deteccin VISA en el
Laboratorio

MICs de Vancomicina de mtodos automatizados


estn mejorando pero no son perfectos.
La Prueba de Difusin de Disco de Vancomicina no
se debe trabajar
Solucin: adicionar Placa de Agar Screen
Vancomicina
(preferiblemente
preparado
comercialmente) por lo menos a Staphylococcus
aureus por mtodos manuales o automatizados
Para Etest, usar un inculo estndar (0.5
McFarland) y Agar Mueller-Hinton.

Procedimiento: A. Screen
Vancomicina

Usar Placas de agar preparado


comercialmente
Preparar una suspensin con 4 a 5 colonias
en caldo o solucin salina a 0.5 McFarland,
mezclar en vortex.
Usar asa calibrada de 1 o 10-l o pipeta para
inocular en la placa (hasta 6 cepas/placa)

Procedimiento: A. Screen
Vancomicina

Dejar que el inculo se absorba.


Invertir las placas e incubar a 35C en
ambiente aerbico
Examinar despus de 16-18 hrs. de
incubacin; si no hay crecimiento, reincubar y examinar 24 horas despus.
Crecimiento >1 colonia es positivo para
VISA/VRSA
Confirmar identificacin; no realizar MIC
automatizado

Funcin del Lab de


Microbiologa

Cada laboratorio debe tener a un miembro de su

personal con el tiempo, inters, y especializacin


para la direccin en las pruebas de susceptibilidad y
resistencia.
Esta persona debe estar leyendo las publicaciones
pertinentes, conectarse una red con otros
laboratorios, y evaluar las pruebas potencialmente
tiles para descubrir nuevos mecanismos de
resistencia antes de que CLSI recomiende nuevas
pruebas disponibles
Ken Thomson, Emerging Infect. Dis., 2001