Tema 3.

3 Anlisis estructural de enzimas.

1.-Determinacin de la Masa molecular.
2.- Determinacin de la composicin aminoacdica y estructura
primaria.
3.- Estructura secundaria y terciaria.
Determinacin estructural: RMN, Cristalografia.

4.- Estructura cuaternaria.

Determinacin sub-unidades, tipo
Funcionalidad

1.- Determinacin de la Masa molecular.

Tcnicas electroforticas
Electroforesis en gel.

D istancia encm

Podemos estimar la masa molecular

relativa con el uso de marcadores

Controlar la pureza

Tcnicas cromatogrficas
Cromatografa por filtracin en gel: Tamao
Las protenas se separan por exclusin molecular mediante el uso de bolitas
porosas de un polmero insoluble como dextrano o agarosa (Sephadex, Sepharosa).
Se determina Vo con Blue Dextran
Ve se determina para cada protena
Vt se calcula de la frmula r 2 x h
Kav =Ve-Vo / Vt-Vo

Espectrometria de masas
MALDI-TOF: matrix-assisted laser desorption-ionization-time of flight

ESI: electrospray ionization mass spectrometry

MALDI-TOF
Se generan iones de las protenas
y se aceleran a travs de un campo
elctrico.

Se determina el tiempo que tardan

en ser detectados que es funcin
de su masa.

Resultado de una espectrometra de masas

Informacin del peso molecular

Permite la conversin en concentracin de protenas en
solucin a Molaridad
1. Composicin:
cuntos aminocidos de un tipo hay en la molcula?
2.- Actividad cataltica
cuntas molculas de substrato son transformadas por
una molcula de enzima por segundo?
3.- Uniones a ligandos
cuntas molculas de ligando se une por molcula de
enzima?

2.- Determinacin de la composicin aminoacdica y

estructura primaria.
Las protenas son polmeros lineales formados por monmeros llamados aminocidos

1. Ayuda a conocer su mecanismo de accin. Identificacin

de regiones funcionales en una enzima
2. Interpretar datos estructurales cristalogrficos, RMN.
3. La secuencia determina la estructura tridimensional

Los aminocidos se unen entre si mediante enlace covalente de tipo amida

(R-CO-NH-R) para formar pptidos
Las protenas son polmeros lineales formados por monmeros llamados aminocidos

Enlace peptdico
-El equilibrio est ms desplazado hacia la hidrlisis, por ello la formacin del enlace requiere un
aporte de energa (ATP).
-Sin embargo el enlace peptdico es cinticamente muy estable y en ausencia de un catalizador, el
tiempo de vida en disolucin acuosa es de 1000 aos.

Estructura primaria
Corresponde a la posicin de cada aminocido en la secuencia codificada por
el ADN
Cada protena tiene una secuencia de aa s nica y definida con precisin

Enlace peptdico

METODOS TRADICIONALES DE SECUENCIACIN

Composicin aminoacdica de cadenas polipeptdicas
Identificacin del extremo amino terminal
Reacciones del grupo amino:
- Reaccin de Edman: Fenilisotiocianato. Absorbancia a 254nm
- Reaccin de Sanger: 1-fluoro,2,4 dinitrobenceno (FDNB). Ab. 360nm
- Reaccin con el cloruro de dansilo: compuestos fluorescentes.
- Reaccin con la ninhidrina o fluoroescamina. compuestos fluorescentes.

Reaccin de EDMAN
: 254 nm

Fenilisotiocianato

Degradacin de EDMAN

Hasta 50 residuos contiguos de un polipptido

Polipptidos de gran tamao

1. Romper la protena en fragmentos por mtodos qumicos o enzimticos
2. Romper puentes disulfuros
3. Purificar cada fragmento y secuenciarlo por Degradacin de EDMAN
4. Determinar el orden de los fragmentos y dnde se localizan, si los hay, los
puentes disulfuros.

Rotura de puentes
disulfuros

Mtodos para fragmentar las cadenas polipeptdicas

METODOS ACTUALES DE SECUENCIACIN

Secuenciacin MS-MS

3.- Determinacin de la estructura secundaria y terciaria.

Estructura secundaria

Disposicin regular y repetida del esqueleto de la cadena polipeptdica en

una direccin determinada. No se tienen en cuenta las cadenas laterales

Slo se permiten los giros alrededor de los enlaces C-N y C-C

El carcter parcial de doble enlace del enlace peptdico limita la capacidad de
rotacin del mismo

Los ngulos de giro (ngulos de torsin) se denominan: (fi) y (psi).

Estructura secundaria

Los valores para los giros fi y psi estn comprendidos

entre 180 y -180

Estructura secundaria
Cules son los valores estricamente permitidos ?
Indica los valores de los ngulos fi y psi de conformaciones permitidas

Plot de Ramachandran

Las posibilidades de giro van a determinar en gran

medida el plegamiento de las protenas

Estructura secundaria
En principio un pptido puede adoptar muchas conformaciones diferentes
segn los ngulos phi y psi

Adopta la ms favorable desde el punto de vista energtico:

menores impedimentos estricos
menor repulsin electrosttica
Existen dos tipos de estructuras secundarias
termodinmicamente favorables

-Hlice

Hoja plegada

Estructura secundaria: -hlice

Puente de H
n y n+4

Estructura secundaria: -hlice

- 57
- 47

Estructura secundaria: -hlice

Radicales hacia el exterior

de la hlice
NO PARTICIPAN DE LA
ESTRUCTURA SECUNDARIA

Restricciones para la formacin de una -hlice

1- Repulsin o atraccin electrosttica entre aminocidos cargados.

2- Volumen de los grupos R adyacentes. No podran ir seguidos varios

aminocidos voluminosos.
3- Interacciones entre cadenas laterales de aminocidos separados por
3 4 residuos.
4- Presencia de prolina. X-Pro.

Estructura secundaria: hojas-

Los puentes de H conectan un residuo con dos

residuos de la cadena adyacente (grupo NH de R1
y el CO de R2 de la cadena adyacente y entre el grupo CO de
R1 y el NH de
R3 de la cadena adyacente)

Las hojas antiparalelas son ms estables

por la alineacin de los puentes de H

Protena globular con alto contenido en estructura

Concanavalina A

Las diferentes estructuras secundarias co-existen

en una misma protena

Estructura secundaria: giros, codos o lazos

Permiten el giro de 180 en la direccin de las cadenas polipeptdicas

Estabilizado por puentes de H entre el aa1 y el aa4 (aai e aai+3)

Estructura suprasecundaria
Agrupaciones estables de estructuras secundarias frecuentes en las protenas.

Motivos estructurales
Todo alfa

Unidad

Todo beta

Barril

Meandro

Alfa-beta

Unidades

Estructura supersecundaria o motivos

Todo alfa

Hlice-vuelta-hlice.
Siete hlices transmembrana.
Mano EF.
Cremallera de leucina.

- Horquilla
Todo beta - Meandro
- Barril
Alfa-beta

- Dedo de Zn.
- Motivo

Dos -hlices cortas.

Todo alfa

Dos -hlices yuxtapuestas

Interaccionan entre s mediante
cadenas laterales de leucina
(cremallera de leucina)

Siete hlices
transmembrana

bacteriorrodopsina

Mano EF

Protenas de unin
al ADN reguladoras
de la transcripcin
(c-fos, c-jun)

Presente en protenas
que se unen a calcio
como calmodulina o troponina

Todo beta

Horquilla beta

Barril beta

Dos estructuras adyacentes

orientadas de forma antiparalela

Protena que se une al retinol humano

Meandro

Alfa-beta

Dedos de Zinc
Estructuras alfas y betas unidas por un tomo
de Zinc que interacciona con Cys e His

Protenas de unin a ADN

Dedo de Zn

Motivo

Estructura subterciaria
Dominio:
Parte de la cadena polipeptdica que tiene un plegamiento propio
e independiente del resto de la protena (Unidad de plegamiento).

La unin estable de varios motivos da lugar a los dominios.

Frecuentemente asociado a una funcin especfica.

Protenas de ms de 200 residuos

Estructura subterciaria

Dominio
Dominio

Dominio

Regiones de 100 a 150 aminocidos

Estructura terciaria
Disposicin tridimensional de todos los tomos de una protena

Mioglobina

Estructura terciaria
Fuerzas que estabilizan la estructura terciaria
Interacciones dbiles

Inicas (puentes salinos)

Hidrofbicas
Enlaces de hidrgeno
Fuerzas de Van derWaals

Interacciones covalentes
Entre restos de Cys

RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR

Ncleos en diferentes ambientes resonaran a

frecuencias de radiacin distintas

Protena con 55 aminocidos

B-sheet

Efecto de la proximidad de dos ncleos

NOESY Nuclear Overhause Enhancement Spectroscopy

Muestra pares de protones muy cercanos menor de 5 A

Magnetizacin se transfiere

Protena de 55 aminocidos

Diagonal
Primera dimensin

Genracin de protenas marcadas 13C,

15
N y 2H
RMN en tres dimensiones

Dominio de dedo de Zn

CRISTALOGRAFA RAYOS X

Longitud de onda igual longitud

que el enlace covalente

Protenas cristalizan en la configuracin biolgica activa

Los electrones de los tomos dispersan los rayos X

La forma de dispersin dependen del ordenamiento
atmico

Transformacin de Fourier

Mapas de densidad electrnica

4. Estructura cuaternaria
Hace referencia al ordenamiento de
diferentes subunidades en una
protena multimrica

Uniones no covalentes
Interacciones dbiles

Inicas (puentes salinos)

Hidrofbicas
Enlaces de hidrgeno
Fuerzas de Van derWaals

1. Cuantas sub-unidades y de que tipo?

Estudios de evaluacin Peso Molecular
Estudios de determinacin de peso molecular. Agentes desnaturalizantes (Guanidina)
Tipos y nmero de subunidades (precaucin trazas de proteasas, al disociar las subunidades)

Estudios de crosslinlinking

Agentes qumicos: Dimetilsuberimidato

Desnaturalizacin SDS

Determinacin
Peso molecular
SDS-PAGE

4X

3X

2X

Estudios de uniones a ligandos

Nmero de sitios de una enzima por un substrato indica el nmero

de sub-unidades (Disposicin de las sub-unidades)
Alcohol DH Levadura
Hgado

2 moles de NADH/mol ADH (Dmero)

4 moles de NADH/mol ADH (Tetramero)

Estudios de simetria

Estudios de Cristalografa Ejes de simetria

Aspartato carbamoiltransferasa 6 unidades catalticas y 6 regulatorias
Estudios de identidad de sub-unidades

Secuenciacin N-terminal y C-terminal

Espectrometra de masas de las sub-unidades

2.Enzimas oligomricas: Funcionalidad

1. Aumenta la posibilidad de regulacin cataltica
2. Variaciones en la propiedades catalticas
Ej.Triptofano Sintasa Protenas Multienzimticas.
3. Estabilidad. Lactato DH
4. Generacin de estructuras complejas con funciones
biolgicas. Economa informacin gentica
Proteasoma