Ingeniera

gentica
de
plantas
Lucero

Denisse
Moctezuma
Estrella
Roman Rdz.
Ana L. Garca

Introduccin
Las palabras biotecnologa o ingeniera

gentica se estn introduciendo a nuestra

vida. La mayora de los ciudadanos presentan
inters de saber si estos conceptos
representan confianza, peligro, debido a la
falta de informacin.
Como consecuencia se abren mltiples
posibilidades de desarrollar nuevas tecnologas
de produccin que pueden tener un gran
impacto en la industria, en el medio ambiente,
alimentos y en la salud del ciudadano.

Conceptos generales
El genoma de
una planta
contiene
alrededor de
25.000 genes

Ingeniera Gentica
Tcnicas que permiten alterar las

caractersticas de un organismo mediante

la modificacin dirigida y controlada de su
genoma, aadiendo, eliminando o
modificando alguno de sus genes.

Planta transgnica
Planta cuyo genoma ha sido modificado

mediante ingeniera gentica, bien para

introducir uno o varios genes nuevos o para
modificar la funcin de un gen propio. Como
consecuencia de esta modificacin, la
planta transgnica muestra una nueva
caracterstica.
Una vez realizada la insercin o
modificacin del gen, ste se comporta y se
transmite a la descendencia como uno ms
de los genes de la planta.

Cmo se hace una Planta

transgnica
Consta de dos etapas fundamentales:

transformacin y regeneracin.
Transformacin: proceso de insercin del

gen que se pretende introducir (tambin

llamado transgn) en el genoma de una
clula de la planta a transformar. La
regeneracin consiste en la obtencin de
una planta completa a partir de esa clula
vegetal transformada.

Por qu hacer plantas

transgnicas

Las clulas vegetales tienen por fuera de

la membrana plasmtica una fuerte pared

de celulosa, que supone un verdadero
obstculo fsico para la entrada de genes.
Para salvar este problema se pueden
seguir dos estrategias, o bien liberar a la
clula de esta barrera fsica, o bien disear
sistemas que dirijan el DNA al interior de la
clula incluso en presencia de la pared.
Estos ltimos son los mtodos

denominados de biobalstica,

TRATAMIENTO PREVIO A LA TRANSFORMACION

Para la transformacin se suelen utilizar

protoplastos, que son clulas vegetales a
las que se les ha eliminado la pared celular
por medio de tratamiento enzimtico con
celulasa y pectinasa. Se suelen emplear
clulas de hoja, que son fciles de dispersar y
regeneran muy bien la planta completa.
Los protoplastos al estar desprovistos de
la pared externa facilitan la penetracin de
molculas de DNA y por tanto son clulas ms
fciles de transformar.

Otro

sistema
alternativo
muy
utilizado es la transformacin de
discos de hoja. Se recortan pequeos
discos, de algunos milmetros de
diametro, de una hoja. Las clulas de
su borde pueden ser facilmente
transfectadas por el plsmido.

En cualquier caso, bien se trabaje con

clulas en cultivo o con protoplastos,

para modificar genticamente una
planta se requiere introducir genes
exgenos en el interior del ncleo de
una clula vegetal y para ello hay que
recurrir a vectores que transporten el
gen o los genes, o bien utilizar tcnicas
que permitan la introduccin directa
del transgen.

Basados en Plsmidos y Virus

Basados en mtodos fsicos y qumicos

Es necesario disear la construccin de DNA

adecuada que contenga el gen o genes de
inters, pero tambin algunos elementos
necesarios para asegurar su correcta expresin.
Estos son las regiones reguladoras y el
promotor del gen que permitirn que el gen sea
activo y que lo sea en el momento y en el lugar
correcto, es decir, que la protena o protenas
se sinteticen en las clulas del tejido donde
debe hacerlo.
Adems, suele ser muy til introducir en la
construccin otros genes que llamaremos
marcadores de seleccin, que tambin se
suelen denominar reporteros, que permitiran
confirmar que se ha producido la integracin.

Transformacin de
Plantas por
Agrobacterium
tumefaciens (Plsmido Ti )
Agrobacterium tumefaciens es una bacteria Gram

negativa capaz de infectar plantas a travs de

heridas, se adhiere a la pared externa de una clula,
desde aqu, es capaz de transferir fragmentos del
plsmido Ti, que se encuentra normalmente en el
interior de estas bacterias, hasta el ncleo
de la clula vegetal e inducir la formacin
de tumores en las plantas infectadas.

La clula vegetal que ha adquirido el plsmido

se convierte en una clula tumoral, creciendo

de manera independiente y no regulada, y se
dedica
a
sintetizar
unos
aminocidos
especiales, las opinas, y otros compuestos nica
y exclusivamente para alimentar a la bacteria.
El plsmido Ti tiene un tamao muy grande, es
un DNA circular de unas 200Kb. Sin embargo, al
interior de la clula vegetal solo penetra un
fragmento de este plsmido, llamado T-DNA
(DNA transferido), que tiene un tamao de
entre 12 y 24 Kb, dependiendo de la cepa
bacteriana.

Esta regin tiene una serie de caractersticas

muy interesantes:
Una vez en el interior de la clula, el T-DNA no

permanece como un plsmido independiente

sino que se integra en uno de los cromosomas
de la planta.
El T-DNA lleva una serie de genes, algunos de

los cuales codifican para enzimas

intervienen en la sntesis de opinas.

que

El mecanismo de infeccin

de Agrobacterium involucra
la transferencia e integracin
de una regin del plsmido Ti
al genoma de la clula
vegetal. Para que esta regin
sea transferida a la planta,
los genes vir necesitan ser
activados por
"acetosyringone (compuesto
fenolico que produce la
planta cuando tiene una
herida).

agrobacterium
rizogenes y el plasmido
Ri
Otro vector especfico es el plsmido Ri
(inductor de raz) de la bacteria
Agrobacterium ryzogenes, cuya utilizacin
sigue bsicamente el mismo proceso que
acabamos de comentar para el Ti.
Este plsmido cuando infecta una
planta produce raicillas, o aparicin de
mltiples races por una proliferacin
desordenada de las clulas de la raz.

Transformacion de
plantas por vectores
viricos
Las ventajas de los virus radican en la eficiencia

para la transferencia genica, la facilidad con la

que pueden infectar celulas intactas, la rapidez
con la que pueden extenderse a otras partes de
la planta y el amplio espectro de plantas que
pueden abarcar.
Tipos:
Virus DNA: -virus del mosaico de la coliflor y los

geminivirus.
Virus RNA: -virus del mosaico del bromo y del
mosaico del tabaco.

El virus del mosaico de la

coliflor
Este se considero inicialmente ideal por ser de pequeo tamao

(8kb) y tener DNA de doble banda que puede ser manipulado

mas facilmente in vitro. Es muy infeccioso, pero la organizacin
de su genoma es compleja y compacta. Solo se han identificado
dos genes como no-escenciales y estos son muy pequeos;
ademas la capside es de pequeo tamao y no admite DNA
extra.
La replicacion tambien es compleja y requiere un paso atravez de

RNA, lo cual puede introducir errores, puesto que la transciptasa

inversa carece de actividad correctora. Un aspecto positivo es
que el promotor del gen VI es muy eficiente y ha sido utilizado en
la expesion de otros genes.

Geminivirus
Son atractivos porque algunos miembros del grupo infectan

monocotiledoneas ademas de dicotiledoneas. La biologia

molecular de estos virus no es muy conocida. Uno de los mas
estudiados dentro de las limitaciones mencionadas es el virus
estriado del maiz. Este virus se transmite a la planta
solamente a traves de un saltamontes, produciendo unas
estriaciones amarillentas en las hojas del maiz.
El genoma intacto no se ha podido introducir en la planta;

consta de una sola hebra de DNA, carece de intermediarios,

RNA, y origina un gran numero de copias en el nucleo de las
celulas infectadas

El virus del mosaico del

bromo
Es un virus pequeo, que posee varias piezas

de RNA como genoma. Infecta numerosas

monocotiledoneas, incluyendo cereales.
En plantas los virus de RNA son mucho mas

frecuentes que los de DNA, adems muchos

de estos virus son filamentosos, por lo que el
tamao de la partcula del virus lo determina
el tamao del genoma, y por lo tanto, no
existir limitaciones de tamao para insertos.

Virus del mosaico del

tabaco
Virus de RNA de hebra sencilla en una sola pieza.
El gen bacteriano CAT (cloranfenicol acetil

transferasa) se coloca justamente antes del

codon de iniciacin en la protena de la cpside.
Se inoculan hojas de plantas de tabaco y se
detecta actividad CAT, sin embargo, la infeccin
no se extiende al resto de la planta.
Se sabe que la propagacin del virus al resto de
la planta depende, no solo de una protena de la
cpside intacta, sino tambin de la protena de
movimiento (PM) del virus.

METODOS QUIMICOS

Mtodo de fosfato
Calcico
Basado en la obtencin de un precipitado
entre el CaCl2 y el DNA en una solucin salina
de fosfatos. En esta situacin coprecipitan
formando unos agregados que son
endocitados/fagocitados por las clulas.
Aparentemente el agregado con Ca protege al
DNA de la degradacin por la nucleasas
celulares.
Desventaja: que se ve afectado por factores
tales como el cambio de pH en la solucin, etc.

Metodo de DEAE
Dextrano
Basado en la obtencin de complejos entre la

resina DEAE y el DNA. Los polmetros de DEAE

dextrano o polybreno tienen una carga que les
permite unirse a las muy negativamente
cargadas molculas de DNA. El DNA
acomplejado se introduce en las clulas
mediante choque osmtico mediante glicerol.
Desventaja: El uso de DEAE dextrano se limita

a las transfecciones transistentes.

Mtodo de lipofeccin
Se basa en la formacin de complejos entre lpidos

cationicos y DNA. El complejo tiene afinidad por la

membrana y permite la entrada del DNA al citosol.
Existe un gran numero de lipidos que se emplea en

lipofeccion aunque existe una extructura consenso de

un lipido cationico sintetico, apatrir del cual se han
diseado muchas variantes (DOPE). Es esencial
optimizar las condiciones especficas de transfeccin
para obtener buenas eficiencias, que suelen ser en
buenas condiciones de entre el 70 y el 90% de las
clulas de la placa.
Desventaja: elevado precio de lipidos, no todos los lipidos

funcionan con todos los tipos celulares

Electroporacin
La membrana se hace permeable por este

metodo.
Consiste en aplicar descargas elctricas de alto
voltaje a las clulas para producir poros
nanomtricos en sus membranas. El DNA entra en
la clula a travs de los poros, o al redistribuirse
los componentes de la membrana con el cierre de
estos.
El mtodo se lleva a cabo colocando la suspensin

de las clulas y el DNA en una pequea cubeta y

aplicando descargas de 2.0 a 4.0 kv a 0C.

Ultrasonicacin
Impulsos ultrasnicos de una

intensidad acstica de 0.5 W/cm2 se

aplicaron a segmentos de hoja
durante 30 minutos. El DNA lo
introducen en su genoma y lo
transmiten a sus descendientes.

Transferencia gentica
por bombardeo
Las pistolas gnicas
Que puede introducir DNA directamente en

clulas epidrmicas usando unas partculas de

tungsteno de 4 n cubiertas de DNA del
vector. Se han logrado transformar por este
mtodo clulas epidrmicas de cebolla con
una eficiencia de hasta el 44 por 100 , aun no
igualada por ningn otro mtodo

Bombardeo de clulas

embrionarias de 12 das. Con

partculas de oro recubiertas de
DNA expulsadas de un acelerador
de partculas elctrico.

Sistema de
Microproyectiles
Bombardeo de clulas con DNA, que lo
mantiene en solucin. Un pistoletazo pone
en movimiento una nube de microgotas
aceleradas por una corriente de gas en un
pequeo capilar segn la ley de Bernoulli.
Las microgotas conteniendo el DNA y
microproyectiles salen despedidas a
grandes velocidades produciendo diminutas
incisiones en las clulas receptoras por
donde el DNA puede penetrar.