Anda di halaman 1dari 24

PENGENDAPAN

Pengendapan merupakan suatu


cara klasik untuk pemisahan
bermacam protein dengan cara
membuat bagian dari campuran
protein mengendap.
Penggolongan protein :

1.Albumin

mudah larut dalam air dan air


berkadar garam rendah
mengendap dalam larutan yang
berkadar garam
ammonium
sulfat 70%.
Kelarutan protein ditentukan oleh
distribusi residu hidrofilik atau
hidrofobik
pada
permukaan
molekul protein

2. Golongan globulin
tidak mudah larut dalam air
Larut dalam larutan yang
berkadar garam rendah
Mengendap dalam larutan
garam tinggi
3. Golongan prolamin
tidak larut dam air
larut dalam alkohol 50 90%

Gambar 1. Distribusi muatan hidofob pada protein

Kelarutan protein ditentukan


1. Interaksi polar dengan air
2. Interaksi dengan garam
3. Gaya tolak menolak elektrostatik antar
molekul ber-muatan

Macam-macam pengendapan:
1. Pengendapan melalui titik isoelektrik
Pada daerah titik isoelektrik (muatan
mendekati nol) kelarutan proten menurun
Gaya tolak menolak antar molekul turun

Prinsip Pengendapan dg
garam
Jika pada larutan protein
ditambahkan garam netral
misalnya ammonium sulfat
maka kelarutan protein
tidak hanya tergantung
pada muatan dari garam,
tetapi tergantung pada
muatan anorganik.

Penambahan garam yang tinggi (salting


out)
interaksi protein dengan air menurun
protein mengendap
Urutan pengendapan dimulai dari protein
yang kelarutannya kecil
Perlu diperhatikan: pH, suhu dan jenis
garam yang digunakan
Garam yang efektivitasnya tinggi
misalnya garam yang bermuatan negatif
ganda: sulfat, fosfat, sitrat.

Fraksionasi dengan amonium sulfat dengan


tingkat kejenuhan yang berbeda-beda pada
ekstrak enzim tertentu.

Percobaan
1

Kejenuhan
(NH4)2SO4

Enzim yang
diendapkan
(%)

Protein yang
direndahkan
(%)

Kemurni
an

0 40

25

40 60

62

22

2,8

60 80

22

32

1,0

80 supt

21

Kesimpulan : Enzim yang dipisahkan/dimurnikan mengendap pada tingkat


kejenuhan 40-60 lebih besar jika dibandingkan dengan tingkat kejenuhan 60-80,
kita coba lakukan 45-70%.

Percobaan
2

Kejenuhan
(NH4)2SO4

Enzim yang
diendapkan
(%)

Protein yang
direndahkan
(%)

Kemurni
an

45 70

38

38

2,4

70 supt

30

30

Kesimpulan : Recovery pada percobaan (2) lebih baik dibandingkan dengan


percobaan (1), tetapi kemurniaan enzim kurang baik dibandingkan percobaan (2).
Kalau pada percobaan ini penekanannya pada kemurniaan dengan recovery tidak
terlalu rendah, kita coba 48-65%.

Percobaan
3

Kejenuhan
(NH4)2SO4

Enzim yang
diendapkan
(%)

Protein yang
direndahkan
(%)

Kemurni
an

0 48

10

35

48 65

75

25

3,0

65 supt

15

40

Keuntungan
Suspensi protein dalam
ammonium sulfat 2-3M
stabil dalam beberapa
tahun
Konsentrasi garam yang
tinggi dapat mencegah
proteolisis
Penyimpanan
endapan
protein
dalam

3.Pengendapan dengan pelarut organik


Banyak digunakan dalam industri,
terutama pemisahan protein plasma
Prinsip: adanya pelarut organic (larut
dalam air). Akan menyebabkan
kekuatan solvasi pada daerah
permukaan protein yang hidrofobik
berkurang.

Susunan
molekul
air
pada
permukaan
protein
yang
hidrofobik diganti oleh molekul
organic,
sehingga
kelarutan
protein meningkat, sebaliknya
untuk protein yang larut dalam
air kelarutannya berkurang
Protein yang berat molekulnya
besar
akan
lebih
dahulu
mengendap

Gambar 2. Agregasi protein dalam campuran pelarut organik

Aseton (pelarut organik) dapat menyebabkan protein


terdenaturasi, harus dilakukan pada suhu dibawah
nol derajat celsius
Pengaruh pelarut organik terhadap larutan
protein:

Aseton reduksi konstanta dieletrik dari air


penggantian dari molekul air
mobilitas partikel dari molekul air melalui
fibrasi
Pelarut organik yang ditambahkan kedalam
satu liter protein untuk membuat pelarut dari
x% menjadi y%:
1000 (y x) mL
(100 y)

Pengendapan
organik

dengan

polimer

Polimer
yang
digunakan:
Polyetilenglikol
Berat molekul : 6.000 s/d 20.000
20% PEG dapat mengendapkan
beberapa komponen protein plasma

Polaritas medium dan Kekuatan


ion
Pemurnian protein yang berasal
dari membran atau subselular
yang perlu dipertimbangkan
adalah kepolaran solven
Sukrosa,
gliserol,
dimetilsulfoksida,
dimetil-formamida
dapat digunakan untuk protein
yang hidrofobik

Kalium
klorida,
natrium
klorida, ammonium klorida,
dan ammonium sulfat dapat
digunakan
untuk
mempertahankan aktivitasnya
Penilmetilsulfonol
fluorida
(PMSF)
sebagai
inhibitor
protease.
Dietilprokarbonat
sebagai
inhibitor R-nase

Suhu
Beberapa protein stabil pada suhu 0oC.
walaupun ada beberapa protein yang
sensitif pada suhu ini misalnya enzim
piruvat karboksilase
Enzim piruvat karboksilase stabil pada
suhu 25oC
Untuk mencegah kerusakan protein
dalam
mencair
bekukan
dapat
ditambahkan sedikit gliserol atau
dimetilsulfoksida

Stabilisasi protein atau enzim


agar tetap aktif merupakan
kerjaan yang sangat sulit.
Perlu
pH diperhatikan:
Tingkat oksidasi
Konsentrasi logam berat
Polaritas medium
Konsentrasi protease
Suhu

Tingkat oksidasi
Kebanyakan protein mengandung
gugus sulfidril bebas
Oksidasi gugus sulfidril dapat
menurunkan aktivitas
Konsentrasi 4 x 10-3 M 2merkaptoetanol, sistein, tioglikolat
dapat mencegah terjadinya ikatan
sulfida.