PENGGUNAAN TEKNIK

RT-PCR & RFLP - RFLP PROBE

UNTUK ANALISIS
MIKROBIOLOGI DALAM
MAKANAN (CLOSTRIDIUM
BOTULINUM DAN SHIGELLA)

YOSSI FITRIANTI S.FARM, APT

1421012009
PASCASARJANA FARMASI UNAND

FOODBORNE DISEASE
Foodborne disease adalah penyakit yang
disebabkan karena mengkonsumsi makanan atau
minuman yang tercemar.
Penyakit yang ditularkan melalui makanan
(foodborne disease) yang segera terjadi setelah
mengkonsumsi makanan, umumnya disebut
dengan keracunan. Makanan dapat menjadi
beracun karena telah terkontaminasi oleh bakteri
patogen yang kemudian dapat tumbuh dan
berkembang biak selama penyimpanan, sehingga
mampu
memproduksi
toksin
yang
dapat
membahayakan manusia (BPOM RI, 2008).

KIAT PENCEGAHAN

M
U
I
D
I
R
T
S
O
CL
M
U
N
I
L
U
T
O
B

Clostridium botulinum
C. Botulinum pertama kali diisolasi dari kasus
keracunan botulism yang terjadi pada abad ke19.
Isolat tsb kemudian dinamakan Bacillus botulinus,
namun setelah diteliti ternyata bakteri ini memiliki
spora anaerob sehingga Bangston memasukkannya
kedalam genus Clostridium .

Clostridium botulinum
Salah satu bakteri patogen pada makanan dengan
karakteristik : bakterigram-positif, berbentuk batang,
bersifat anerob yang berarti organisme-organisme ini
tumbuh paling baik pada tingkat-tingkat oksigen yang
rendah
atauketidakhadiran
oksigen,
dapat
membentuk spora dan memproduksi racunsyaraf
yang kuat, sporanya tahan panas dan dapat bertahan
hidup dalam makanan dengan pemrosesan yang
kurang sesuai atau tidak benar
Ketika kelembaban dan bahan bergizi ada dan oksigen
tidak ada (seperti pada usus atau botol atau kaleng
bersegel), spora tersebut mulaibertumbuh dan
menghasilkan racun, Beberapa racun dihasilkan oleh
Clostridium botulinum yang tidak dapat dihancurkan
oleh enzimpelindung usus.

Ekologi Clostridium
botulinum

Penyebaran bakteri Clostridium botulinum adalah

melalui spora yang dihasilkan oleh bakteri tersebut.
Spora Clostridium botulinum dapat ditemukan di
saluran pencernaan manusia, ikan, burung, dan
hewan
ternak.
Selain
itu,
jugadapatditemukanditanah, pupuk organik, limbah,
dan hasil panen.
Spora tersebut dapat berakhir di usus hewan yang
memakan hewan atau tumbuhan yang terkontaminasi
spora tersebut kemudian memasuki rantai makanan
manusia.
Jika spora memasuki lingkunganyang anaerob,
misalnya pada kaleng makanan, spora tersebut akan
tumbuh menjadibakteri yang dapat menghasilkan
neurotoksin.

Ekologi Clostridium
botulinum

Pada makanan yang tertutup dan pHnya lebih dari 4,6

merupakan tempat pertumbuhan bakteri C.botulinum.
Faktor lain yang mendukung tumbuhnya spora
menjadi sel vegetatif adalah kadar garam yang di
bawah 7%, kandungan gula di bawah 50%,
temperatur 40C 490C, kadarkelembapan tinggi,
serta sedikitnya kompetensi dengan bakteri flora.

Tanda-tanda kerusakan pada makanan

kaleng yang disebabkan oleh
Clostridium botulinum
produk mengalami fermentasi
berbau asam, bau keju atau bau butirat
pH sedikit di atas normal dengan tekstur rusak
penampakan pada keleng memperlihatkan bahwa
kaleng menggembung jikadibiarkan terus
menerus mungkin bisameledak.

Toksin Clostridium
botulinum
Clostridium botulinummenghasilkan toksin yang
disebut
neurotoksin
atau
BoNT
(botulinum
neurotoxin). Neurotoksin ini merupakan eksotoksin
karena toksin dikeluarkan oleh bakteri ke lingkungan
serta neurotoxin paling kuatyang pernah ditemukan.
Racun yang dihasilkan oleh Clostridium botulinum
akan diserap di dalam lambung, duodenum dan
bagian pertama jejunum. Kemudian akan diedarkan
oleh darah dan menyerang saraf.
Toksin botulinumini memilikistruktur dan fungsi yang
sama dengan toksin tetanus. Namun, toksin botulinum
mempengaruhi syaraf periferi karena memiliki afinitas
untuk neuron pada persimpangan otot syaraf.

Toksin Clostridium
botulinum
Terdapat
tujuh
macam
toksin yang berbeda-beda
yang dihasilkan oleh C.
botulinum, yaitu tipe A, B,
C, D, E, F, dan G. Tipe A, B,
E,
dan
F
dapat
menyebabkan
botulisme
pada manusia. Tipe C dan
D menyebabkan sebagian
besar
botulisme
pada
hewan (unggas liar dan
unggas ternak, sapi, kuda,
dan beberapa jenis ikan).
Tipe G telah diisolasi dari
tanah di Argentina, belum
ada kasus yang diketahui.

Pada siklus yang normal, asetilkolin akan dilepaskan oleh

vesikel pada ujung serabut saraf. Asetilkolin akan
memasuki sinaps dan memfasilitasi transfer impuls saraf
dengan membuat jembatanpada gap antara ujung
serabut saraf dengan sel reseptor otot sehingga
komunikasi sel dapat berlangsung.

Mekanisme Racun oleh

Botulinin
Pada orang yang mengalami keracunan akibat toksin
botulinin, racun akan memasuki deaerah membran sel
ujung serabut saraf. Molekul-molekul toksin tersebut
akan menutupi permukaan bagian dalam dari membran
selt ersebut sehingga menghalangi vesikel yang akan
melepaskan asetilkolin dan terjadi paralisis.

Gejala keracunan
makanan oleh
Clostridium
botulinum
Gejala dimulai 1824 jam setelah makan makanan yang
terkontaminasi Clostridium botulinum.
Gejala-gejalanya : bibir kering, gangguan penglihatan
(inkoordinasi
otot-otot
mata,
penglihatan
ganda),ketidakmampuan menelan, sulit berbicara; tandatanda paralisis bulbar berlangsung secara progresif, dan
kematian terjadikarena paralisis pernapasan atau jantung
berhenti.
Gejala-gejala gastrointestinal biasanya tidak menonjol.
Tidak ada demam. Penderita tetap sadar segera sebelum
mati.

SHIGELLA
Shigella adalah bakteri penyebab
penyakit shigellosis pada manusia.
Bakteri ini merupakan bakteri patogen
usus yang dikenal sebagai agen
penyebab penyakit disentri basiler.
Shigella tahan terhadap keasaman
lambung dan membutuhkan inokulum
yang kecil untuk menyebabkan diare
sehingga mudah ditularkan ke orang
lain. Penularan terjadi dalam kondisi
banyak orang berkumpul dalam satu
tempat seperti di penitipan anak, panti
asuhan atau tempat penampungan.
Rendahnya sanitasi dan pasokan air
yang buruk dapat memberi sumbangan
terhadap peningkatan risiko infeksi.

MORFOLOGI
Shigella merupakan bakteri berbentuk batang
pendek , Gram-negatif, tidak motil, tidak berflagel,
tidak berkapsul, tidak membentuk spora, bentuk
coccobacilli terjadi pada pembenihan muda. Ukuran
shigella sekitar 2-3m x 0,5-0,7 m dan susunannya
tidak teratur. Shigella dapat tumbuh subur pada suhu
optimum 37oC, hidup secara aerobik maupun
anaerobik fakultatif.
Shigella dibagi dalam empat serogrup berdasarkan
komponen-komponen utama antigen O yaitu:
1. Grup A: Shigella dysenteriae
2. Grup B: Shigella flexneri
3. Grup C: Shigella boydii
4. Grup D: Shigella sonnei

TOXIN
1.Endotoksin
Infeksi hampir selalu terbatas pada saluran
pencernaan, invasi ke aliran darah sangat jarang dan
sangat menular. Infeksi di usus akut ini adalah disentri
basiler/ Shigellosis yang dapat sembuh sendiri. Reaksi
peradangan yang hebat tersebut merupakan faktor
utama yang membatasi penyakit ini hanya pada usus.
Selain itu juga menyebabkan timbulnya gejala klinik
berupa demam, nyeri abdomen, tenesmus ani (mulas
berkepanjangan tanpa hasil pada hajat besar). Waktu
terjadinya autolysis semua bakteri Shigella sp
mengeluarkan
lipopolisakaridanya
yang
toksik.
Endotoksin mungkin akan menambah iritasi pada
dinding usus.

TOXIN
2.Eksotoksin
Eksotoksin merupakan protein yang antigenik
(merangsang
produksi
antitoksin).
Aktivitas
enterotoksin terutama pada usus halus, yang berbeda
bila dibandingkan dengan disentri basiler klasik
dimana yang terkena adalah usus besar. Sebagai
eksotoksin zat ini dapat menimbulkan diare
sebagaimana enterotoksin yang tidak tahan panas.
Pada manusia eksotoksin menghambat absorbsi gula
dan asam amino pada usus kecil. Neurotoksin ini juga
ikut berperan dalam menyebabkan keparahan
penyakit dan sifat infeksi Shigella dysenteriae, serta
menimbulkan
reaksi
susunan
saraf
pusat
(meningismus, koma).

PATOGENITAS
Bakteri tertelan masuk dan berada di usus halus
menuju ileum terminal dan kolon melekat pada
permukaan mukosa berkembang biak reaksi
peradangan hebat, sel-sel terlepas, timbul Ulkus terjadi
disentri basiler (tinja lembek, bercampur darah, mukus
dan pus, nyeri abdomen, mules, tenesmus ani).
Masa inkubasinya adalah 2-4 hari, atau bisa lebih lama
sampai 1 minggu. Oleh seseorang yang sehat diperlukan
dosis 1000 bakteri Shigella untuk menyebabkan sakit.
Penyembuhan spontan dapat terjadi dalam waktu 2-7 hari
terutama
pada
penderita
dewasa
yang
sehat
sebelumnya, sedangkan pada penderita yang sangat
muda atau tua dan juga pada penderita dengan gizi
buruk penyakit ini akan berlangsung lama. Pernah
ditemukan terjadinya septicemia pada penderita gizi
buruk dan berakhir dengan kematian.

SIKLUS HIDUP SHIGELLA

Reverse
Transcriptase
Polymerase
Chain Reaction
(RT-PCR)

PCR
PCR pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh
Kary B. Mullis.
PCR adalah suatu metode enzimatis menggunakan enzim
DNA polimerase (enzim termostabil dari bakteri termofilik
Thermus aquaticus) untuk amplifikasi DNA dengan cara in
vitro.
Amplifikasi DNA pada PCR dapat dilakukan bila
menggunakan primer oligonukleotida yang disebut
amplimers yaitu suatu sekuens oligonukleotida pendek
yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA. Umumnya
primer yang digunakan pada PCR terdiri dari 20-30
nukleotida
PCR memungkinkan dilakukannya pelipatgandaan suatu
fragmen DNA.
DNA template (cetakan) yaitu fragmen DNA yang akan
dilipatgandakan dan berasal dari patogen yang terdapat

KOMPONEN UTAMA PCR

a.

DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan

dilipatgandakan. DNA cetakan yang digunakan sebaiknya
berkisar antara 105 106 molekul. Dua hal penting yang
perlu diperhatikan adalah kemurnian dan kuantitas
cetakan.
b.
Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen
oligonukleotida pendek (18 28 basa nukleotida) yang
digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. Dan
mempunyai kandungan G + C sebesar 50 60%.
c. Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP), terdiri dari dATP,
dCTP, dGTP, dTTP. dNTP mengikat ion Mg2+ sehingga
dapat mengubah konsentrasi efektif ion yang diperlukan
untuk reaksi polimerasi.

KOMPONEN UTAMA PCR

d.

Enzim DNA Polimerase, yaitu enzim yang melakukan

katalisis reaksi sintesis rantai DNA. Enzim ini diperoleh
dari Eubacterium yang disebut Thermus aquaticus,
spesies ini diisolasi dari taman Yellowstone pada tahun
1969. Enzim polimerase taq tahan terhadap pemanasan
berulang-ulang yang akan membantu melepaskan ikatan
primer yang tidak tepat dan meluruskan wilayah yang
mempunyai struktur sekunder.
e.
Komponen pendukung lain adalah senyawa buffer.
Larutan buffer PCR umumnya mengandung 10 50mM
Tris-HCl pH 8,3-8,8 (suhu 20o C); 50 mM KCl; 0,1% gelatin
atau BSA (Bovine Serum Albumin); Tween 20 sebanyak
0,01% atau dapat diganti dengan Triton X-100 sebanyak
0,1%; disamping itu perlu ditambahkan 1,5 mM MgCl2.

TAHAPAN PROSES PCR

1. Denaturasi
Denaturasi DNA merupakan proses pembukaan
DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal,
biasanya berlangsung sekitar 3 menit, untuk
meyakinkan bahwa molekul DNA terdenaturasi
menjadi DNA untai tunggal.
Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA
mengalami renaturasi (membentuk DNA untai
ganda lagi) secara cepat, dan ini mengakibatkan
gagalnya proses PCR.
Waktu denaturasi yang terlalu lama dapat
mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase.
Aktifitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh >
2 jam, 40 menit, 5 menit masing-masing pada suhu
92,5; 95 dan 97,5oC.

TAHAPAN PROSES PCR

2. Annealing (penempelan primer)
Kriteria untuk merancang primer yang baik adalah
primer sebaiknya berukuran 18 25 basa, mengandung
50 60 % G+C.
Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR
adalah 30 45 detik. Semakin panjang ukuran primer,
semakin tinggi temperaturnya. Kisaran temperatur
penempelan yang digunakan adalah antara 36oC
sampai dengan 72oC, namun suhu yang biasa dilakukan
itu adalah antara 50 60oC.

TAHAPAN PROSES PCR

3.Pemanjangan Primer (Extention)
Selama tahap ini Taq polymerase memulai
aktivitasnya memperpanjang DNA primer dari ujung
3.
Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim
tersebut pada suhu 72oC diperkirakan 35 100
nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH,
konsentrasi garam dan molekul DNA target. Dengan
demikian untuk produk PCR dengan panjang 2000
pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup
untuk tahap perpanjangan primer ini. Biasanya di
akhir siklus PCR waktu yang digunakan untuk tahap
ini diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh
produk PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda.

Gambar siklus PCR

(1) Denaturasi pada suhu 90o
95oC;
(2) Annealing pada suhu 37o 65oC;
(3) Ekstensi pada suhu 72oC ;
(4) Siklus pertama selesai

Produk PCR dapat diidentifikasi melalui ukurannya dengan

menggunakan elektroforesis gel agarosa. Metode ini terdiri
atas penginjeksian DNA ke dalam gel agarosa dan
menyatukan gel tersebut dengan listrik. Hasilnya untai
DNA kecil pindah dengan cepat dan untai yang besar
diantara gel menunjukkan hasil positif.

KEUNGGULAN PCR
Spesifitas, efisiensi dan keakuratannya tinggi.
Spesifitas PCR terletak pada kemampuannya
mengamplifikasi sehingga menghasilkan produk
melalui sejumlah siklus.
Keakuratan yang tinggi karena DNA polymerase
mampu menghindari kesalahan pada amplifikasi
produk.
Dapat diperoleh pelipatgandaan suatu fragmen
DNA sebesar 200.000 kalinya setelah dilakukan 20
siklus reaksi selama 220 menit.

KEUNGGULAN PCR
Reaksi ini dilakukan dengan menggunakan
komponen dalam jumlah sangat sedikit, dimana
DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5 ug
oligonukleotida atau sekitar 1 mM dari reaksi
(biasa dilakukan dalam volume 50-100 ul)
DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu
dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCR
dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu
sekuen DNA dalam genom bakteri hanya dengan
mencampurkan kultur bakteri di dalam tabung PCR

KELEMAHAN PCR
Biaya PCR yang masih tergolong tinggi.

JENIS PCR
1. Restriction Fragment Length Polymorphism
(RFLP)
metode ini digunakan untuk membedakan
organisme berdasarkan analisis model derivat
dari perbedaan DNA.
2. Inverse-PCR
metode ini digunakan bila hanya satu sekuen
internal yang diketahui. Metode ini khusus
digunakan untuk mengidentifikasi sekuen
antara dari beragam gen.

JENIS PCR
3. Nested-PCR
proses ini memungkinkan untuk mengurangi
kontaminasi pada produk selama amplifikasi dari
penyatuan primer yang tidak diperlukan
4. Quantitative-PCR
digunakan untuk pengukuran berulang dari hasil
produk PCR. Metode ini secara tidak langsung
digunakan untuk mengukur kuantitas, dimulai dari
jumlah DNA, cDNA, atau RNA. Hasil dari metode
ini juga menampilkan copy dari sampel

JENIS PCR
5. Reverse Transcriptase (RT-PCR)
metode ini digunakan untuk amplifikasi, isolasi atau
identifikasi sekuen dari sel atau jaringan RNA.
Metode ini dibantu oleh reverse transcriptase
(mengubah RNA menjadi cDNA), mencakup
pemetaan, menggambarkan kapan dan dimana gen
diekspresikan.
6. Random Amplified Polymorphic DNA ( RAPD )
bertujuan untuk mendeteksi polimorfisme pada
tingkat DNA. Metode ini dikembangkan oleh Welsh
and Mc Clelland (1990) dengan cara
mengkombinasikan teknik PCR menggunakan primer
primer dengan sequens acak untuk keperluan
amplifikasi lokus acak dari genom.

RT - PCR
Teknik ini dikembangkan untuk melakukan analisis
terhadap molekul RNA hasil transkripsi
Teknik RT-PCR dikembangkan untuk mengatasi
kelemahan-kelemahan metode PCR yang lain.
Berbeda dengan teknik analisa PCR yang
menggunakan DNA sebagai target, RT-PCR
menggunakan RNA sebagai targetnya.
Melibatkan enzym reverse transcriptase, yang
akan mensintesa compelementary DNA (cDNA)
dari template RNA, oleh karena itulah teknik ini
dinamakan RT-PCR.

RT - PCR
RT-PCR digunakan secara luas untuk menganalisis
virus-virus enterik karena virus ini memiliki genom
RNA, diantaranya : hepatitis A, virus Norwalk,
rotavirus dan SRSVs.
Protokol analisis untuk enterovirus ini juga
dikembangkan untuk mendeteksi bakteri dan
organisme tingkat tinggi lain.
Messenger RNA (mRNA) merupakan target yang
sangat berguna untuk PCR. mRNA ini berada
dalam jumlah yang relatif banyak di dalam sel
hidup, dan memiliki sensitivitas yang tinggi.
Molekul ini merupakan indikator berlangsungnya
kehidupan suatu sel.

RT - PCR
Beberapa organisme yang dapat dideteksi dengan
metode ini adalah : Legionella, Vibrio, Giardia.
RNA tidak dapat digunakan sebagai cetakan pada
teknik PCR, oleh karena itu perlu dilakukan proses
transkripsi balik (reverse transcription)
terhadap molekul mRNA sehingga diperoleh
molekul cDNA (complementary DNA).
Molekul cDNA digunakan sebagai cetakan dalam
proses PCR.
Teknik RT-PCR ini sangat berguna untuk
mendeteksi ekspresi gen, untuk amplifikasi RNA
sebelum dilakukan cloning dan analisis, maupun
untuk diagnosis agensia infektif maupun penyakit
genetik

ENZIM YANG DIGUNAKAN

DALAM RT- PCR
Teknik RT-PCR memerlukan enzim transcriptase balik
(DNA polymerase) yang menggunakan molekul DNA
(cDNA) sebagai cetakan untuk mensintesis molekul cDNA
yang komplementer dengan molekul RNA tersebut.
Beberapa enzim yang digunakan adalah :
Mesophilic viral reverse transcriptase (RTase)
RTase bersifat sangat prosesif dan mampu menyintesis
cDNA sampai sepanjang 10 kb
Tth DNA polymerase
Tth DNA polymerase mampu menyintesis cDNA sampai
sepanjang 1-2 kb.
Enzim Tth DNA polymerase mempunyai keunggulan
karena dapat digunakan untuk reaksi transkripsi balik
sekaligus proses PCR dalam satu langkah reaksi.

Reaksi transkripsi balik dapat

dilakukan dengan menggunakan
beberapa macam primer yaitu
Oligo (dT) sepanjang 12-18 nukleotida yang akan
melekat pada ekor poli (A) pada ujung 3 mRNA. Primer
semacam ini pada umumnya akan menghasilkan cDNA
yang lengkap.
Heksanukleotida acak yang akan melekat pada
cetakan mRNA yang komplementer pada bagian
manapun. Primer semacam ini akan menghasilkan
cDNA yang tidak lengkap (parsial).
Urutan nukleotida spesifik yang dapat digunakan
secara selektif untuk menyalin mRNA tertentu.

PRINSIP RT-PCR
RT-PCR menggunakan sepasang primer, yang
berkomplemen dengan sequens yang jelas dari
masing-masing dua untai cDNA. Primer tersebut
kemudian diperpanjang dengan bantuan enzim DNA
polymerase dan akan menghasilkan sebuah untai
gandaan pada setiap siklusnya dan seterusnya
mengikuti amplifikasi logaritmik

TAHAPAN PROSEDUR RT-PCR

Tahap pertama adalah reverse transcription (RT)
RNA ditranskrip balik menjadi cDNA menggunakan
enzim reverse transcriptase dan primer. Tahap ini
sangat penting, karena berkaitan dengan performa
PCR untuk amplifikasi cDNA dengan bantuan DNA
polymerase sebab DNA polymerase hanya dapat
bekerja pada templet yang berupa DNA.
Tahapan RT (Reverse Transcripsion) dapat dilakukan
dalam tabung yang sama dengan PCR (one-step PCR)
atau pada tabung yang terpisah (two-step PCR)
menggunakan suhu berkisar 40C sampai 50C,
tergantung pada karakteristik reverse transcriptase
yang digunakan.

TAHAPAN PROSEDUR RT-PCR

Tahap kedua adalah denaturasi DNA pada suhu 95C

Pada tahap ini dua untai DNA akan terpisah dan primer
dapat mengikat pada untai tersebut jika temperaturnya
diturunkan selanjutnya akan dimulai rantai reaksi baru.
Kemudian suhu diturunkan hingga mencapai suhu
anealing yang bervariasi tergantung primer yang
digunakan, konsentrasi, probe dan konsentrasi kation.
Perhatian utama saat memilih temperatur anealing
optimal adalah melting temperatur dari primer dan
probe (jika digunakan).

TAHAPAN PROSEDUR RT-PCR

Tahap kedua adalah denaturasi DNA pada suhu 95C

Temperatur annealing yang dipilih untuk PCR tergantung
langsung pada panjang dan komposisi dari primer yang
digunakan. Hal ini merupakan hasil dari perbedaan
ikatan hidrokarbon antara A-T (2 ikatan) dan G-C (3
ikatan).
Temperatur annealing biasanya berkisar 5 derajat di
bawah temperatur terendah dari pasangan primer yang
digunakan.

TAHAPAN PROSEDUR RT-PCR

Tahap akhir adalah Amplifikasi PCR
Dilakukannya perpanjangan DNA menggunakan Primer
yang memerlukan Taq DNA polymerase yang
termostabil, biasanya pada suhu 72C, yang merupakan
suhu optimal untuk aktivitas enzim polymerase.
Lamanya masa inkubasi tiap temperatur, perubahan
suhu dan jumlah siklus dikontrol secara terprogram
menggunakan programmable thermal cycler.
Analisa produk PCR tergantung pada kebutuhan PCR. Jika
menggunakan PCR konvensional, maka produk PCR
dapat dideteksi dengan agarose gel electrophoresis dan
ethidium bromide (atau dye nukleotida lainnya).

Restriction Fragment Length

Polymorphism (RFLP) dan RFLPprobe

DNA

DNA merupakan jenis asam nukleat

yang menyimpan semua informasi
genetika. DNA merupakan blueprint
segala aktivitas sel yang akan
diturunkan ke generasi berikutnya. DNA
umumnya terletak di dalam inti sel.
Struktur DNA terdiri atas dua untai
yang berpilin membentuk struktur
double helix. Masing-masing untai
terdiri atas rangka utama dan basa
nitrogen yang menyatukan dengan
untai DNA lain.

Page 49

DNA merupakan polimer yang terdiri

dari tiga komponen utama, yaitu gugus
fosfat, gula deoksiribosa dan basa

DNA

Sebuah unit monomer DNA yang terdiri

dari ketiga komponen tersebut
dinamakan nukleotida, sehingga DNA
tergolong sebagai polinukleotida.
Rangka utama untai DNA terdiri dari
gugus fosfat dan gula yang berselangseling.
Empat basa yang ditemukan pada DNA
adalah adenin (A), sitosin (C), guanin
(G) dan timin (T).
Adenin berikatan hidrogen dengan
timin, sedangkan guanin berikatan
dengan sitosin.

Page 50

DNA

Setiap DNA tersusun dari ekson yang

merupakan daerah yang mengkode protein
dan intron yang berupa daerah non-coding,
biasanya disebut junk DNA.
Dalam DNA kromosom terdapat sekuens
berukuran 20-100 bp yang berulang.
Potongan pengulangan ini dikenal sebagai
VNTRs (Variable Number Tandem Repeats)
yang dapat diisolasi dari DNA individu.
Perbedaan VNTRs dari setiap individu
terletak pada berapa kali sequence ini
diulang dalam daerah VNTRs. Tidak ada
individu yang memiliki VNTRs sama persis,
sehingga memungkin untuk mengetahui
indentitas individu melalui profil DNAnya.

Page 51

Restriction Fragment Length

Polymorphism (RFLP)
RFLP dikenal juga sebagai restriction enzym analysis
(REA) atau bacterial restriction endonuclease digest
analysis (BRENDA), dikarenakan pemotongan DNA
menjadi fragmen-fragmen dilakukan suatu enzim yang
disebut enzim restriction endonuclease (RE)
Enzim ini bekerja memotong DNA pada site yang
spesifik berbeda dengan enzim DNAses yang
memotong DNA secara random. Site yang spesifik ini
dikenal juga dengan recognition sequences.
Site ini terdiri atas urutan basa nukleotida spesifik,
yang hanya dikenali oleh enzim RE bukan enzim
lainnya. Panjang urutan basa nukleotida ini bervariasi
antara 4 8 atau lebih basa nukleotida.

Restriction Fragment Length

Polymorphism (RFLP)
Teknik RFLP ini tidak hanya bergantung kepada enzim
restriksi endonuklease (RE) akan tetapi juga pada
kromosom DNA terkait, karena strain yang sama akan
sangat berbeda dalam hal urutan basa nukleotidanya.
Suatu strain pada beberapa bagian kromosomnya
dapat memiliki urutan basa nukleotida yang dikenali
oleh RE, akan tetapi strain yg sama lainnya bisa
memiliki perbedaan urutan basa nukleotida sehingga
tidak lagi dikenali oleh RE atau malah sebaliknya.
Jadi 2 strain dengan urutan basa nukleotida yang
berbeda seperti digambarkan diatas, dapat berbeda
dalam jumlah dan panjang fragmen yang dihasilkan
atau terjadi polimorfisme dalam panjang fragmen hasil
restriksi tsb

Pembuatan DNA fingerprinting dengan teknik

analisa RFLP meliputi dua tahap :
1.

Pemotongan DNA dengan enzim restriksi

Tabung eppendorf yang berisi larutan DNA ditambahkan
buffer restriksi dan BSA (Bovine Serum Albumin). Buffer
restriksi (RE buffer) berfungsi untuk membuat dan
mempertahankan suasana pH, ionic strength, dan kation
yang sesuai (optimum) dengan kerja enzim restriksi
sehingga enzim restriksi dapat bekerja secara optimal.
Sedangkan BSA berperan sebagai stabilisator bagi
enzim restriksi serta mencegah terjadinya adhesi antara
enzim dengan dinding tabung reaksi. BSA tidak akan
berpengaruh pada enzim yang tidak membutuhkan
stabilisator.

Enzim restriksi
Enzim restriksi yang digunakan terdiri dari
campuran EcoRI dan PstI.
Enzim EcoRI berasal dari bakteri Eschericia coli
Enzim PstI berasal dari bakteri Providencia stuartii.
Enzim EcoRI akan memotong pada sekuens
GAATTC
Enzim PstI akan memotong pada sekuens sebagai
berikut :
5' - CTGCAG - 3' 3' - GACGTC - 5'
5' - CTGCA|G - 3' 3' - G|ACGTC - 5'
5' -CTGCAG- 3' 3' -GACGTC- 5'

Faktor yang mempengaruhi kerja enzim

restriksi
1. Komposisi Buffer
Penggunaan buffer yang berbeda akan menyebabkan
kerja enzim dalam memotong menjadi tidak optimal.
2. Adanya DNA yang termetilasi
Sebagian besar enzim restriksi tidak dapat memotong
DNA yang termetilasi karena enzim tersebut tidak
mampu mengenali sisi pemotongannya, hal ini
disebabkan oleh adanya modifikasi atau metilasi.
3. Suhu inkubasi
Suhu inkubasi suatu enzim bergantung pada asal enzim
restriksi tersebut diambil. Suhu inkubasi enzim restriksi
umumnya adalah 37oC. Namun apabila enzim restriksi
tersebut diperoleh dari bakteri termofil, suhu
inkubasinya adalah sekitar 50 65oC.

Pembuatan DNA fingerprinting dengan teknik

analisa RFLP meliputi dua tahap :
2.

Pemisahan hasil pemotongan dengan

elektroforesis gel agarosa
Setelah DNA dipotong dengan enzim restriksi, DNA
dianalisis dengan gel elektroforesis. Gel elektroforesis
merupakan salah satu metode yang digunakan untuk
pemisahan, pendeteksian dan pemurnian molekulmolekul Biologi, seperti asam nukleat dan protein.
Pemisahan dilakukan pada matriks yang berupa gel.
Sampel DNA yang terpotong akan bergerak dalam gel
agarosa yang telah dialiri listrik bertegangan 90mV.
Kemudian DNA tersebut akan membentuk band-band
yang dapat dilihat menggunakan alat berupa
transiluminator UV. Kemudian akan nampak band-band.
Dari band tersebut dapat dibuat peta restriksi DNA
plasmid dari ukuran fragmen-fragmen DNA yang
dihasilkan pada pemotongan dengan enzim restriksi dan

Teknik Pengerjaan

RFLP - Probe
Walaupun metode RFLP ini menghasilkan pola
fragmen yang lengkap, tetapi belum bisa
segera dibandingkan/ dianalisis menggunakan
komputer.
Penentuan strain dilakukan menggunakan
Probe asam nukleat untuk melihat perbedaan
polanya sehingga diistilahkan dengan analisis
RFLP-probe.

RFLP - Probe

Metode ini diaplikasikan untuk mengidentifikasi bakteri

penyebab penyakit yang disebabkan makanan seperti :
Campylobacter, E.Coli, Listeria, Salmonella dan Shigella juga
digunakan untuk ragi dan jamur pada makanan penyebab

Pendekatan teknik RFLP Probe

Teknik ribotyping, yang menggunakan basa probe
dari rDNA, gen yang meng-enkode RNA ribosomal.
Teknik ribotyping ini digunakan untuk
mengidentifikasi sejumlah bakteri penyebab
penyakit yang disebabkan makanan seperti :
Aeromonas, Campylobacter, E. Coli, Listeria,
Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus,
Vibrio dan Yersinia. Teknik ribotyping ini ada yang
sudah otomatis yakni DuPont, dimana alat ini
menjamin tingkat reproducibility yang tinggi,
memiliki kemampuan menghasilkan ribotypes
library atau database, tetapi biayanya cukup
mahal.

Pendekatan teknik RFLP Probe

Pendekatan lainnya adalah PCR-RFLP, yang
melibatkan teknik amplifikasi gen ttt dengan PCR,
kemudian dilanjutkan dengan pemotongan oleh
enzim RE dan pemisahan fragmen pada gel
agarosa. Teknik ini dapat digunakan untuk
mengidentifikasi gen yang meng-enkode toxin
pada Campylobacter, Cl. Botulinum, Cl. Perfringen,
E.Coli, Shigella, Vibrio, dan Yersinia.

Penelitian yang telah dilakukan :

Review journal : DNA based methodes used for
characterization and detection of food borne bacterial
pathogens with special consideration to recent raid
methodes, African Journal of Biotechnology vol.8 (9), pp
1768-1775, 4 May 2009.
Isolasi dan identifikasi bakteri patogen dari makanan menggunakan metode
biokimia dan imunologi memiliki banyak kekurangan, selain menghabiskan banyak
waktu juga kurang sensisitiv bila dibanding dengan molecular methode. Sehingga
menuntut untuk pengembangan metode yang lebih sensitif dan cepat. Polimorfisme
DNA yang terjadi pada berbagai bakteri telah digunakan untuk mengidentifikasi
pathogen pada makanan. Peningkatan database sekuens DNA bakteri membimbing
pada design deteksi dan kuantifikasi yang lebih baik. Dalam hitungan menit
sejumlah DNA target dapat diamplifikasi dengan teknik PCR sehingga dapat
dilakukan analisis secara luas pada mikroorganisme yang patogen pada makanan.
Beberapa metode itu adalah : RFLP, PFGE, Ribotyping, Hibridisasi DNA probe,
Amplifikasi DNA dan PCR, NASBA, LCR, RAPD, AFLP, Multiplex PCR vs Primer
universal, Real time PCR, LAMP, Gold nanoparticle based biosensor, Fibre optic
bisensor, electric biosensor, dll.

Penelitian yang telah dilakukan :

Quantification of Clostridium botulinum Toxin Gene
Expression by Competitive Reverse Transcription-PCR,
Applied and Enviromental Microbiology, pp 1423-1428, Apr
2000.
Clostridium botulinum menghasilkan neurotoksin botulinum yang menyebabkan
kondisi neoruparalitik yang fatal disebut botulism. Walaupun kasus ini jarang terjadi
akan tetapi sebuah industri makanan harus menjamin produknya aman dari bakteri
ini. Sebelumnya bakteri ini dianalisis dengan metode mouse bioassay, namun
metode ini mahal, lambat dan dianggap tidak etis. Pada penelitian ini diperkenalkan
uji baru yakni competitive RT-PCR untuk memonitor produksi neurotoxin botulinum
tsb. Metode ini mengukur dengan tepat jumlah toxin yang meng-enkode mRNA
pada sel C.botulinum. Pengukuran mRNA ini menghasilkan penilaian yang baik
terhadap ekspresi gen mRNA bakteri, selain itu mudah, spesifik, sensitif dan lebih
baik dari metode mouse bioassay yang biasa dilakukan.

Penelitian yang telah dilakukan :

Determination of Neurotoxin Gene Expression in Clostridium
botulinum Type A by Quantitative RT-PCR, Mol Cells Vol,22,
No.3, pp 336-342, September 2006.
RT-PCR
digunakan untuk mengidentifikasi expresi gen neurotoxin
botulinum type A (BoNT/A) (cntA) oleh 16S rRNA. Kasus keracunan pada
umumnya disebabkan oleh C. Botulinum Type A. Metode ini dikonfirmasi
dengan memonitor jumlah mRNA dari cntA selama pertumbuhan 5 strain
BoNT/A ini. Penggunaan teknik RT-PCR ini dapat digunakan untuk mengquantifikasi jumlah
transkrip neurotoksin C. Botulinum tpe A dan
mengetahui efek dari zat yang ditambahkan ke pangan yang berisiko
menimbulkan keracunan botulinum.

Penelitian yang telah dilakukan :

Molecular genotyping of Shigella sonnei Strains Isolated From
Children With Bloody Diarrhea Using Pulsed Field Gel
Electrophoresis on the Total Genome and PCR-RFLP of IpaH and
IpaBCD genes, Jundishapur J Microbiol, 2015 January.
Penelitian ini bertujuan untuk analisa epemiologi secara molekular
isolat Shigella yang diperoleh dari sampel diare anak-anak di
Shiraz (Iran Selatan), menggunakan IpaH and IpaBCD RFLP. 82
strain Shigella spp diisolasi dari 719 sampel feses pasien diare,
yang berumur 2 bln s/d 14 tahun, yang positif tes occult blood (OB)
yang dikarakterisasi berdasarkan gen IpaH and IpaBCD pada pola
PCR-RFLP. DNA strainShigella sonnei kemudian dianalisa dengan
PFGE. Adapun strain shigella yang diuji : S.sonnei, S.flexneri,
S.boydii, S.dysentriae.
Deteksi gen Ipa dilakukan dengan mengamplifikasi gen IpaH and
IpaBCD dengan PCR. Untuk ekstraksi DNA, koloni Shigella
disuspensikan pada air suling steril dan dididihkan selama 3 menit
dan bagian suspensi tsb diuji dengan alat PCR. Amplifikasi
dilakukan dalam sebuah thermal cycler sesuai metode Aranda dan

Parameter siklus thermal untuk uji PCR tsb tdd denaturasi pada
suhu 940C selama 2 menit, annealing primer pada suhu 550C
selama 2 menit dan pemanjangan primer pada suhu 72 0C
selama 3 menit. Ampifikasi dilakukan sebanyak 35 kali siklus,
menggunakan molekul penanda (100-bp DNA ladder, MBI,
Fermentas, Lithuania). Elektroforesis dilakukan menggunakan
gel agarosa 1,5% untuk memastikan ukuran yang telah
diamplifikasi. Fragmen IpaH yang diamplifikasi dari PCR dicerna
oleh enzim restriksi Hinfi, Haell, dan fragmen IpaBCD dicerna
oleh enzim restriksi Hinfi dan pstl selama 4 jam pada suhu 370C
didalam buffer MBI,Fermentas,Lithuania. Hasil cerna tadi
dianalisa dengan elektroforesis gel agarosa 2% dengan buffer
tris-acetate EDTA diikuti dengan pewarnaan Ethidium bromida.

Penelitian yang telah dilakukan :

Restriction Fragment Length Polymorphisms in rRNA Operons for
Subtyping Shigella sonnei, Journal of Clinical Microbiology, Nov
1991, p 2380-2384.
Shigella sonnei penyebab terbesar terjadinya shigellosis di US.
Studi epidemiologi organisme ini terhambat oleh belum adanya
prosedur yang sesuai. Analisis DNA Ribosomal (ribotyping), sebuah
metode untuk menganalisa restriction fragment length
polymorphisms pada gen kromosom yang mengenkode rRNA,
yang saat ini dapat dimanfaatkan untuk mengidentifikasi spesies
dan subtyping. Untuk melihat apakah teknik ribotyping dapat
digunakan untuk membeda-bedakan diantara isolat S.sonnei ,
peneliti melakukan Southern hybridization studies dalam
mengisolasi sampel dari 16 lokasi geografi yang berbeda dan jauh
dari kasus keracunan. Fragmen gen DNA S.sonnei dicerna oleh
SalI hybridized dengan E.Coli RNA16S dan 23S untuk
menghasilkan 6 pola yang berbeda, strain pola 1,2,3 disubdivisi
lagi dengan 2 pola tambahan menggunakan PvuII, SmaI dan SstI.

Penelitian yang telah dilakukan :

Restriction Fragment Length Polymorphisms in rRNA Operons for
Subtyping Shigella sonnei, Journal of Clinical Microbiology, Nov
1991, p 2380-2384.
Ternyata strain dengan pola yang identik memiliki epidemiologik
yang saling berhubungan. Teknik ribotyping merpakan tools yang
bermanfaat untuk studi epidemiologi kasus shigellosis yang
disebabkan Shigella sonnei.

TERIMA KASIH