Separacin de clulas

y
fraccionamiento subcelular

Mtodos fsicos de SEPARACION DE CELULAS

* Necesarios para estudiar:

- Tejidos con diferentes tipos celulares
- Clulas con diferente funcionalidad/ actividad biolgica
- Subpoblaciones celulares con diferentes marcadores moleculare
- Alternativa a la clonacin: + rpidos, + rendimiento, (- pureza)

* Los ms empleados explotan diferencias en:

Tamao celular
Densidad
Carga/Qumica superficial
Dispersin de la luz (light scatter)
Emisin de Fluorescencia

Beckman J2-21M, centrfuga equipada con un rotor y sistema de elutriacin

Rotor de elutriacin (Beckman)

Cmaradeseparacindelrotordeelutriacin

Separacion de clulas por elutriacin

Apariencia de las clulas aisladas de una fraccion de elutriacin de clulas sanguneas de

la mdula sea humana cultivadas durante 8 das (a, b). Las clulas predominantes son
de tipo fibroblastoide con un ncleo central, citoplasma difuso y pseudopodos aderentes
y clulas grandes, redondas con un estrecho citoplasma y un ncleo central redondo.
(tincin con hematoxilina). (a) x200; (b) x400. (c) Apariencia de las clulas aisladas de
la misma fraccin de elutriacin y cultivadas en DMEM+20% FCS suplementado con
dexametasona, cido ascorbico y -glicerofosfato durante 8 das. En esas condiciones,
las celulas presentan una morfologia redondeada o cuboidal con un ncleo central, x200.

Separacin de clulas sanguneas con Ficoll-Hypaque

Centrifugacin
Para ver esta pelcula, debe
disponer de QuickTime y de
un descompresor Photo - JPEG.

Para ver esta pelcula, debe

disponer de QuickTime y de
un descompresor Photo - JPEG.

Separacin inmunomagntica

Seleccin
negativa

Seleccin
positiva

Absorcin de luz por un e- y la subsiguiente

emisin de E como calor y fluorescencia

Esquema de un Citmetro de Flujo (FACS)

Funcionamiento de la boquilla vibradora de un citmetro de flujo

Representacin de los datos en citometra de flujo

Green fluorescence

Esquema de un Citmetro
de Flujo clasificador (sorter)

Puede seleccionar 1/1000

clulas y clasificar miles/s

Microdiseccin con lser

Sperm Tail Removal

Biopsy at the Single

Cell Level

Fraccionamiento de componentes
subcelulares
Diseados inicialmente para comprender el papel
bioqumico de cada orgnulo en la clula
La lisis (rotura) celular se suele realizar por:
Potter, homogeneizador mecnico de tejidos,
sonicacin, cavitacin, soluciones hipotnicas
La separacin de los componentes subcelulares se
realiza generalmente por centrifugacin

Homogeneizacin
de la muestra

Centrfuga de alta velocidad

Potter

Fraccionamiento subcelular por centrifugacin diferencial

80.000 x g, 1 h (ultracentrfuga)
1000 x g, 10 min

150.000 x g, 3 h

20.000 x g, 20 min

citosol

5-20%

Comparacin de
la sedimentacin
por velocidad (A)
y por equilibrio
de sedimentacin
(isopcnica, B)

Purificacin de orgnulos por centrifugacin en gradiente de densi

Control de calidad del fraccionamiento: TEM

Ncleos

Microsomas (RER)

Peroxisomas