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INMUNOPRECIPITACIN

e INMUNOBLOT

Inmunoprecipitacin

confirmar la identidad de
una protena, para
cuantificar los niveles de
expresin o para evaluar
las modificaciones
posteriores a la
traduccin.
Determina la presencia y
cantidad de un antgeno,
sntesis y degradacin de
proteinas y otros ligandos

Inmunoprecipitacin

confirmar la identidad de
una protena, para
cuantificar los niveles de
expresin o para evaluar
las modificaciones
posteriores a la
traduccin.
Determina la presencia y
cantidad de un antgeno,
sntesis y degradacin de
proteinas y otros ligandos

Etapas:
1. Marcaje del antgeno
2. Preparacin de las muestras:
Lisis de las clulas para liberar
el Ag
3. Formacin del complejo AgAc
4. Precipitacin de los complejos
Ag-Ac
5. Purificacin de los
inmunocomplejos
6. Anlisis

Preparacin del lisado


celular
Lavar con 10 ml
de PBS enfriado
y centrifugar a
400 G (10
minutos a 4 C)

Lavar las clulas


con PBS helado
y decantar

Suspender el
sedimento en
1ml de tampn
de lisis

Vortex suave,
dejar 30 min en
hielo (mezclar)

Recoger
cuidadosame
nte en un
tubo limpio

Desechar
sobrenadan
te y repetir

Centrifugar a
10.000 G (15 a
30 minutos a 4
C).
Congelar el
lisado de
clulas a
-80C para
almacenarlo

Preparacin de la
inmunopreparacin
Aadir 1-10 mg
de anticuerpo al
lisado celular

Incubar
durante 1 hora
o durante la
noche a 4 C
en un rotador.

Al
sobrenadante
aadir 50 l
de tampn 1X
de Laemmli

Incubar a 4 C
(1 a 2 horas o
durante la
noche) en un
rotador

Centrifugar el
tubo a 2,500 G
(30 segundos a
4 C).

Calentar a 90100C (10


min).
Centrifugar a
10.000 G
(5min)

50 l de
protena A
o G a la
suspensin

3a5
veces

Retirar todo el
sobrenadante.
Lavar con 500
l de tampn
de lisis (Fro)

Recoger el
sobrenadante
y cargar en
un gel de
SDS-PAGE

SDS-PAGE
(Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sdico)

Separar las
protenasde
acuerdo a su
movilidad
electrofortica (en
funcin de la
longitud de la
cadena
polipeptdica,
masa molecular,
modificaciones
postraduccionales)

Inmunoblot

Permite detectar
la presencia,
cantidad y calidad
de un antgeno en
una mezcla
compleja

Consiste en:
1.-Rotura de las clulas o tejidos
con un tampn apropiado.
2.- Electroforesis del extracto
obtenido.
3.-Electrotransferencia de las
protenas a un soporte slido.
4.- Incubacin de la membrana
con el anticuerpo dirigido contra
el antgeno de inters (anticuerpo
primario). Posterior lavado con un
tampn.
5.-Incubacin con anticuerpo
secundario dirigido contra el
anticuerpo primario, por ejemplo

Inmunoblot

Consiste en la separacin electrofortica de proteinas


virales y posterior revelado con anti-IgG.

Clula: PBMC
Antigeno: Itk
Anticuerpo: anti-Itk
Las clulas se analizaron de forma
rutinaria 48 h despus de la
transfeccin.
Procedimientos estndar para la
SDS-PAGE y la inmunoblot.