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Fundamentos de

Espectrofotometra

Ing. Mg. Ricardo Rodriguez Vilchez

Introduccion
En ocasiones al ver una serie en la t.v.; de las policacas o
de mdicos donde se hacen anlisis a pequeas muestras
para averiguar si hay DNA y si este coincide con el de la
vctima o con el malo, o si cierta sustancia puede
afectar a la salud, etc..,
entonces uno ve que los
investigadores
hacen una serie de estudios con las
muestras, que en ocasiones son muy pequeas, y dan
resultados; en la vida real sucede algo similar; cuando se
tiene en el laboratorio, en una solucin, presencia de color,
o cuando se sabe que hay ciertas cantidades de algn
elemento pero no se sabe cuanto, se genera la inquietud
de saber que elemento es, en que cantidad est y es
entonces que se producen una serie de preguntas, tales
como: COMO LO MIDO? y otras ms, entre ellas pueden
estar: Qu es la luz?, qu es longitud de onda, cmo se
mide?, que relacin hay entre luz y color?; para que sirve
esto?, de qu manera se mide una solucin coloreada?.
En este trabajo se propone de orientar de manera sencilla,
sobre este tema tratando de dar una idea fundamental de
las preguntas anteriores y otras ms que se hacen en torno
al tema que se est presentando; espero este trabajo sea
til tanto a profesores como alumnos para orientarse y

Contenido
Espectroscopa
Caractersticas de la Luz
Colores
Qu es longitud de Onda?
Relacin entre frecuencia, velocidad y longitud de
onda
Absorcin / Absorbitividad
Las leyes de Lambert y Beer

Espectrofotometra

Colorimetra y Espectrofotometra como


procedimientos analticos
Fotocolormetro
ESPECROFOTMETRO
Curva Patrn
Referencias e Imgenes

ESPECTROSCOPA
La espectroscopia es el estudio del espectro
de la luz que emiten los cuerpos, sustancias
y elementos.
De este estudio se puede conocer la
composicin, temperatura, densidad,
velocidad de desplazamiento y otros
factores que les son propios y componen a
estos cuerpos, sustancias o elementos

Caractersticas
de la
LUZ

La luz tiene una naturaleza dual:


Como onda
Como una corriente de partculas o
paquetes de energa (fotones)

Albert Einstein desarroll en 1905 la teora de


que la luz estaba compuesta de unas partculas
denominadas fotones, cuya energa era
inversamente proporcional a la longitud de
onda de la luz.

3
1
Foton

La teora electromagntica de la luz propuesta por


Maxwell: La perturbacin que se propaga como ondas de
luz est formada por fuerzas elctricas y magnticas, y
la perturbacin se produce en cargas elctricas en
movimiento.

Efecto de la emisin electromagntica

El efecto fotoelctrico demuestra el


comportamiento de la luz como partcula (grnulos
o corpsculos)

La naturaleza corpuscular de la luz se


observa en fotos de objetos iluminados
muy dbilmente.
La imagen se forma punto a punto, y
muestra que la luz llega a la pelcula
fotogrfica por unidades separadas que
los producen.

Estos descubrimientos dieron origen a toda la


tecnologa moderna de telecomunicaciones como la
televisin

En estas
imgenes se
puede apreciar,
debido a la toma
fotogrfica los
elementos
puntuales que
apoyan a esta
teora

COLORES

Los seres humanos (y algunos animales) apreciamos una


amplia gama de colores que, por lo general, se deben a la
mezcla de luces de diferentes longitudes de onda. Se
conoce como color puro al color de la luz con una nica
longitud de onda o una banda estrecha de ellas.

Cuanto ms larga la longitud de onda de la luz


visible
tanto ms rojo el color.
Asimismo las longitudes de onda corta estn en la
zona violeta del espectro.

As todos los elementos existentes poseen un


espectro
***

COLORES

Hay varios tipos de espectros, los ms


comunes
son
los
espectros
continuos,
espectros de emisin y los espectros de
Si
es colocado frente al espectroscopio se podr ver,
absorcin.
un elemento:
En situaciones en las que se le somete altas
temperaturas y presiones y no se presentan lneas
obscuras se trata de un espectro continuo.
En situaciones normales y se observan unas lneas
de colores frente a un fondo negro, se trata de un
espectro de emisin.
Y por ltimo si sucede la primer situacin y entre el
elemento afectado y el espectroscopio se coloca un
elemento a menor temperatura que el primero, se
obtiene el espectro de absorcin

La luz blanca produce al descomponerla


lo que se llama un espectro continuo, que
contiene el conjunto de colores que
corresponde a la gama de longitudes de
onda que la integran.

Todos los elementos poseen un espectro


propio, que se puede medir al someterse a
temperaturas elevadas ya que producen
espectros discontinuos .

**Para ver espectros de la tabla peridica buscar en esta pgina


http://site.ifrance.com/okapi/quimica.htm **

Qu es
longitud de onda?

ONDA

La distancia entre dos picos (o dos valles) de una onda se


llama longitud de onda ( = lambda).

CARACTERSTICAS DE LAS ONDAS

nodo

La longitud y la frecuencia de onda


son inversamente proporcionales y se
relacionan mediante la siguiente
ecuacin

U.V.

L
u
z
v
i
s
i
b
l
e

X
GAMMA

350 nm

750 nm
Infrarrojo
Microondas
Radio

La luz visible es
slo una pequea
parte del
espectro
electromagntico
con longitudes de
onda que van
aproximadamente
de 350
nanmetros hasta
unos 750
nanmetros
<nanmetro, nm =
milmillonsimas de metro>.

La luz blanca est compuesta de ondas de diversas


frecuencias. Cuando un rayo de luz blanca pasa por un
prisma se separa en sus componentes de acuerdo a la
longitud de onda

As la luz blanca es una mezcla de todas las longitudes de


onda visibles.
En el espectro visible, las diferencias en longitud de
onda se manifiestan como diferencias de color.

La distribucin de los colores se determina por la


longitud de onda de cada uno de ellos.

Las longitudes de onda mas largas que las del rojo se les
conoce como infrarrojas y las mas cortas que el violeta,
ultravioletas.
Longitud de Onda

Ultravioleta

Luz visible

Infrarrojo

102 -104

~ 104

104-107

V
i
o
l
e
t
a
A
z
u
l
V
e
r
d
e
A
m
a
r
i
l
o
N
a
r
a
n
j
a
R
o
j
o

U
V
I
R

400A EspectroVisible 750A

Relacin entre frecuencia,


velocidad y longitud de onda*

Frecuencia natural
Cualquier objeto oscilante tiene
una
'frecuencia
natural',
(vibracin
en
ausencia
de
perturbacin).

frecuencia es el Nmero de vibraciones por


segundo

As Frecuencia, es nmero de veces


que la onda se repite por segundo.

La Frecuencia se mide en Hertz (Hz)

Quin es

HERTZ?

HEINRICH HERTZ (1857-1894), Investigador alemn


que construy un dispositivo para generar y detectar
en un laboratorio ondas electromagnticas,
demostrando su existencia as como, se reflejan
estas ondas, se refractan y se comportan como las
ondas de luz
Estim que la frecuencia f de la onda era de
alrededor de 3 x 107 Hz. Y determin que su
longitud l era de 10 m. Con estos valores estableci
que la velocidad v de la onda es
v = f l = (3 X 107 Hz) X (10 m)
= 3 X 108 m/s = 300 000 km/s

1 Hz (o hercio) es igual a 1 ciclo u


oscilacin por segundo. (1 Hertz = 1
ciclo/seg)
Un kilohercio (kHz) = mil de ciclos por
segundo
Un megahercio (MHz) = un millon de
ciclos por segundo
Un gigahercio (GHz) = mil millones de
ciclos por segundo

Un pndulo de 1 m de longitud
presenta una frecuencia de 0,5 Hz,
es decir que el pndulo va y vuelve
una vez cada 2 segundos.

Longitud de onda = velocidad de propagacin /


frecuencia

= c /
Donde c = vel. de la luz en m. por seg.

c = (m-1s-1)
=c/l

Frec = Vel /
Como la luz viaja a una
velocidad de
3 x 108 m/s

Freclimite luz visible = 3x108 (m/s) / 10-6 (m)=


3x1014 Hz
Es decir: 300 000 000 000 ciclos por segundo

Relacin entre Medidas en valores Hertz y Metros

Las ondas electromagnticas de


frecuencias extremadamente
elevadas, como la luz o los rayos X,
suelen describirse mediante sus
longitudes de onda, que
frecuentemente se expresan en
nanmetros.
Un ejemplo es: Una onda
electromagntica con una longitud
de onda de 1 nm tiene,
aproximadamente una frecuencia de
300 millones de GHz.

vel /
El sonido se propaga a una velocidad de 340 m
cada segundo

La nota La tiene una frecuencia de 440 Hz


= 340 (m/s) / 440 Hz (ciclos por seg) = 0.77 m

4 x 10-5 cm = 400 nm (luz violeta)


7 x 10-5 cm = 700 nm (luz roja)

Algunas equivalencias
1

0.001 mm

10-6 m

nm = m

0.001

10-9 m

0.0001
nm

10-10 m

Comparacin de las mediciones de las


longitudes de onda con la luz visible.

El color de un cuerpo depende de la luz


que recibe, refleja o transmite. Por
ejemplo, el color rojo se d cuando
absorbe en casi su totalidad, todas las
radiaciones menos las rojas, las cuales
refleja o deja pasar dependiendo su
estructura (slida o transparente).

La energa UV es mayor
que, cualquier color del
espectro visible. Sin
embargo los rayos X son
ms energticos que la
luz UV, como se puede
apreciar por su longitud
de onda.

Con base a lo anterior


se puede entender
que
existe
una
relacin inversa entre
la longitud de onda y
la energa del fotn
correspondiente.

Entonces, las energas en el rango ultravioleta-visible


excitan los electrones a niveles de energa superiores
dentro de las molculas y las energas infrarrojas
provocan solo vibraciones moleculares

El color percibido de una solucin depende de la


combinacin de colores complementarios que la
atraviesan

Absorcin
Absorbitividad*

Proceso de Absorcin
La energa de excitacin a una molcula
proveniente de un fotn durante el proceso de
absorcin se representa as:
A + hn A* A + calor

donde:
A es el absorbente en su estado de energa bajo,
A* es el absorbente en su nuevo estado de
excitacin energtica
hn representan a la constante de Planck y la
frecuencia respectivamente

La energa del fotn incidente posee


una longitud de onda ()

A* es inestable y rpidamente
revierte a su estado energtico ms
bajo, perdiendo as la energa
trmica correspondiente.

La absorcin de determinadas
longitudes de onda depende de la
estructura de la molcula absorbente
(absortividad, a)

Cuando un rayo de luz monocromtica con una intensidad I0


pasa a travs de una solucin, parte de la luz es absorbida
resultando que la luz emergente I es menor que I0
Luz incidente (I0)

Luz absorbida

I0

Luz emergente (I)


a=
absortividad

I
c = concentracin
(nmero de partculas por
cm3)

b
Longitud del medio absorbente
o ancho de la celda

Absortividad (a)
a es una constante de proporcionalidad
que comprende las caractersticas
qumicas de cada compuesto, o molcula
y su magnitud depende de las unidades
utilizadas para b y c.

Cuando se expresa la concentracin en moles


por litro y la trayectoria a travs de la celda
en centmetros, la absortividad se denomina
absortividad molar y se representa con el
smbolo .
En consecuencia cuando b se expresa en
centmetros y c en moles por litro.
A=

bc

Donde A representa la absorbancia del


compuesto

Las leyes de Lambert y Beer *


o
los fundam
entos de la
interrelaci
de la luz q
n
ue se abso
rbe y la qu
transmite
e se

Ley de Lambert: cuando un rayo de luz


monocromtica (I0) pasa a travs de un medio
absorbente,
su
intensidad
disminuye
exponencialmente (I) a medida que la longitud del
medio absorbente aumenta

I = I0e-ab
I0

I
1 cm.

I0

I0

2 cm.

Ancho de la celda

3 cm.

Ley de Beer: Cuando un rayo de luz


monocromtica pasa a travs de un medio
absorbente,
su
intensidad
disminuye
exponencialmente a medida que la concentracin
del medio absorbente aumenta

I = I0e-ac
I0

I0

I0

Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la


Ley de Beer-Lambert donde la fraccin de luz
incidente que es absorbida por una solucin es
proporcional a la concentracin de soluto y al espesor de
la sustancia atravesada por la luz. La relacin entre la
luz incidente (I0) y la reflejada (I) dar una idea de la
cantidad de radiacin que ha sido absorbida por la
muestra.

Ley de lambert Beer:

I = I0e

-abc

Si despejamos:

I/I0 = e

-abc

Al cociente de las intensidades se denomina


Transmitancia

T = I/I0 = e-abc
Sacando logaritmos:
Loge I/I0 = abc
Convirtiendo a log10:
Log10 I/I0 = 2.303 abc
Log10 I/I0 = abc

Absorbancia = Log10 I/I0 = abc

La Transmitancia (T) es la relacin


entre la intensidad de luz transmitida
por una muestra problema (I) con la
intensidad de luz incidente sobre la
muestra (I0):

T = I / I0
Se expresa como % T

La absorbancia es directamente
proporcional a la longitud del
recorrido b a travs de la solucin y la
concentracin c del color absorbente.
Estas relaciones se dan como:

A = abc

A menudo b es dada en trminos de cm. y c en gramos por litro,


entonces la absortividad tiene unidades de lg1cm1.

Qu relacin guardan la transmitancia y la


absorbancia?
De acuerdo a las caractersticas de la sustancia
analizada, la luz que no se absorbe atraviesa la
solucin

I0

LUZ
A
B
S
O
R
B
I
D
A

Luz transmitida

T = I/I0

Por lo tanto la absorbancia es reciproca de


la transmitancia
Absorbancia contra concentracin (comportamiento lineal)
Absorbancia

Concentracin

% Transmitancia contra concentracin (pendiente con signo


negativo y comportamiento exponencial)
% Transmitancia

Concentracin

Absorbancia

De loA anterior se desprende que la Absorbancia (A) o luz


que es absorbida por la muestra es igual al logaritmo en
base diez del recproco de la transmitancia (T) o bien al
-log10 de la transmitancia, en el que el disolvente puro o
(blanco) es el material de referencia; esto es:

A = log10 1/T = log101- log10 T = 0 log10 T = log10 T


mg

La representacin grfica correspondiente a


absorbancia y transmitancia en un gradiente de
concentraciones es la siguiente:

bc
Concen
tracin

Obtencin de TRANSMITANCIA utilizando


valores de Absorbancia
Con base en la relacin:

T = 10-abc

y considerando que T se menciona en porcentaje


(%)
%T = 10-abc x 100.
Aplicando logaritmos a la expresin anterior
log10 %T = -abc log

10

10 + log10 100

Invirtiendo trminos
log %T = log10 100 -abc log

10

log10 %T = 2 abc
Como abc = Absorbancia = A
log10 %T = 2 A.

10 = 2 abc * 1

ESPECTROFOTOMETRA

Se le llama espectrofotometra a la medicin


de la cantidad de energa radiante que
absorbe un conjunto de elementos o un
elemento en su estado puro, en funcin de la
longitud de onda de la radiacin lumnica y a
las mediciones a una determinada longitud de
onda.

* Arco iris en
Marte

Cmo se puede medir la radiacin que emiten o


absorben los cuerpos?.
Un aparato capaz de obtener el espectro de
una radiacin, es decir, de separar la radiacin
en sus componentes, se llama un espectroscopio.
Si el aparato es capaz de fotografiarla se llama
un espectrgrafo, y
Si es capaz de medirla diremos que se trata de
un espectrmetro.
Cuando es capaz de medir tambin la intensidad
de la radiacin, se llama espectrofotmetro.

Espectroscopio

Espectgrafo

1817

Espectmetro

De fluorescencia

De Emisin
ptica
Para metales

Imagen de Marte vista con


ayuda de espectmetro de
rayos Gamma

Colorimetra y
Espectrofotometra
como
procedimientos
analticos *

Las
tcnicas
colorimtricas
se
fundamentan con la medicin de la
absorcin de radiacin
visible por
sustancias coloreadas.
Sin embargo, cuando una muestra a
determinar no posee coloracin, es
necesario llevar a cabo un tratamiento de
color empleando substancias que que
reaccionen de forma proporcional con el
compuesto de inters

Las diferentes sustancias se analizan mediante


reacciones coloreadas. Cuanto mayor es la
concentracin de la sustancia a analizar mayor es
el color de la reaccin.

Tambin es posible que la muestra pueda


ser leda cuando su espectro de
absorcin se encuentra en las regiones no
visibles del espectro, como las referentes a
las regiones de UV o Infrarroja

Visn de las abejas

Orbitas de TITAN

Casiopea A: ecos de luz en infrarrojo

La
diferencia
entre
colorimetra
espectrofotometra consiste en el tipo

y
de

instrumental empleado:

El colormetro es un aparato en los que la longitud


de onda se selecciona por medio de filtros pticos
que son insertados en este.

En el espectrofotmetro la longitud de onda es


seleccionada
mediante
dispositivos
monocromadores los cuales estn integrados a la
mquina.

Algunos de los procedimientos colorimtricos o


espectrofotomtricos con los que se cuenta
para precisar la concentracin de una sustancia
en solucin son los siguientes:

Referencia de color
Espectrofotmetro

ESPECTROFOTMETRO

Un
espectrofotmetro
es
un
instrumento que descompone un
haz de luz (haz de radiacin
electromagntico), separndolo en
bandas de longitudes de onda
especficas, formando un espectro
atravesado por numerosas lneas
oscuras y claras, semejante a un
cdigo de barras del objeto, con el
propsito de identificar, calificar y
cuantificar su energa

Distribucin de la luz en el
espectrofotmetro

Espectrofotmetro Mecanismo Interno

Met.Cient. I
COLOR

LONGITUD DE ONDA ()

Rojo (R)
Verde (G)

700 nm
546.1 nm

Azul (B)

435.8 nm

Es usual que al seguir una receta para la


determinacin de la concentracin de un compuesto
en particular se indica una longitud de onda (
especficaa la que hay que leer con el colormetro o
espectrofotmetro.
Porque leer a diferentes (longitudes de onda)
compuestos parecidos pero diferentes?

La explicacin radica en el hecho de que cada


producto qumico se caracteriza por zonas del
espectro visible o no visible en el cual absorbe con
mayor o menor intensidad conformando en su
conjunto el espectro de absorcin de tal sustancia.

Cada compuesto (de complejo a simple) presenta un espectro


de absorcin caracterstico
Absorbancia

Las longitudes de onda con mayor absorcin (picos)


correspondern de forma general a aquellas con las que se
leer la muestra para determinar su concentracin
Absorbancia

La relacin entre la absorbancia por una sustancia a una


determinada y su concentracin es directamente proporcional
es decir: a mayor concentracin mayor proporcin de luz
absorbida.
Absorbanci
a

Conc.

As, el espectro de absorcin de la clorofila es:

Colorante comn, la Rodamina 6G

en Metanol..

Espectro de Absorcin (lnea contnua) y Espectro de


Transmisin (lnea discontnua).

celda de 5uL

La muestra se coloca en una cubeta* de


forma prismtica

Se asume que el tubo, celda o cubeta en la cual


se vierte la solucin a leer no debe desviar la
trayectoria de la luz como requisito para el
cumplimiento de la ley de Beer

Como el cuarzo aparte de ser muy transparente


presenta un comportamiento constante ante la
variacin de la longitud de onda es comn que las
celdas del espectrofotmetro o colormetro sean de
este material .

Curva Patrn
El razonamiento para el
determinacin
de
una
desconocida es:

proceso de
concentracin

A partir de concentraciones conocidas de las


cuales tambin se sabe su absorbancia (curva
patrn), es posible interpolar (intercalar) la
concentracin del problema sabiendo su
absorbancia (lnea roja en figura siguiente)

CURVA PATRN
0.6

0.5

A
B

Absorbancia del problema


0.4

S
0
R

0.3

B
A
N

0.2

Interpolacin

I
A

0.1

0
0

Concentracin mg/lt

10

12

Con base en que la Absorbancia guarda una relacin


lineal con la concentracin, se comprende la existencia
de una relacin de proporcionalidad entre la Absorbancia
y la concentracin:

A1 / A2 = C1 / C2
Donde:
A1 = Absorbancia del problema.
A2 = Absorbancia de un estndar de concentracin
conocida.
C1 = Concentracin del problema.
C2 = Concentracin del estndar.
Si despejamos C1 = Conc del problema

A1 (problema) * Conc estndar

Conc. (problema) =
A2 (estndar)

Un
aspecto
importante
de
la
evaluacin
espectrofotomtrica, es que muchas molculas orgnicas
no absorben en el intervalo del espectro visible sino en el
rango de longitudes de onda acordes al ultravioleta o al
infrarrojo
Por lo que es comn, actualmente, que la mayora de los
espectrofotmetros, actuales, se encuentren provistos
con lo necesario para leer en de tales intervalos
As, los grupos carbonilo presentes en los aldehdos
(RCHO), cetonas (RCOR), cidos carboxlicos (RCOOH),
l steres (RCOOR) y amidas (RCONHR) dan lugar a
absorciones intensas en la regin del espectro de
infrarrojo situada entre 1780-1640 cm-1.

Absorciones mximas (picos de absorcin) de


algunos compuestos que absorben en la regin
ultravioleta:

Grupos funcionales cuyos picos de absorcin se localizan en la


regin del infrarojo

CUIDADOS
Las muestras no deben tener burbujas,
encontrarse turbias o con precipitados.
El volumen de la muestra en la cubeta, no debe
ser excesivo para evitar que se desborde, en caso
de que sucediera, se debe limpiar con un pao
limpio o papel absorbente suave, para evitar
rayarla.
La cubeta se sujeta por los lados opacos.
La cantidad a adicionar es, mximo, hasta
partes de la cubeta
No se deben derramar lquidos, sobre todo
solventes, cidos o lcalis; dentro del
contenedor de la cubeta, se puede daar parte
del mecanismo
Se debe mantener, el espectrofotmetro, limpio y

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