ANLISIS DE PROTENA.

(Mtodos de anlisis)

ANLISIS DE PROTENA
Porqu inters en conocer el contenido total de
proteina en bioproductos y/o alimentos ?
Consumidor: Protena esta asociada con calidad
nutricional ; positivo en alimentos, si la proteina no
es grasa (carnes).
Procesador o industrial: Es el producto final a
producir (frmaco, alimento). Alimentos
-Funcionalidad e.g. espumado, textura (pan),
emulsificacin (caseinas), obscurecimiento (color y
flavour),

ANALISIS PROTEINAS

Porqu inters en conocer el contenido total de

proteina en alimentos ?

Funcionalidad (ejemplos)

Enlaces Disulfuro

Analsis de Protenas

Cual es el inters en sus protenas individuales en esos productos?

Consumidor: Conocimiento sobre las diferencias nutrimentales

(contenido en amino acidos y digestibilidad), alergas provocadas por
protenas

Productor: Costo causado por alergias (cuales son las principales

proteinas que las causan? Trigo, cacahuate, leche),

Frmacos bioactividad, PM, tamao,.

ANALISIS PROTEINAS

Por que interesan los

cambios protecos ocurridos a debido al proceso y/o

almacenamiento?

cambios en la calidad nutricional y funcionalidad. E.g.

calentamiento desnaturaliza proteinas y provoca

ms grandes volumenes para panes, disminucin
en calidad nutricional, prdida de capacidad
emulsificante.

ANALISIS PROTENAS

Proteinas tienen importancia en almacenamiento y funcin

celular
Peso Protenas desde 5000 daltons (5KDa) a > 1 milln
Compuestas de amino acidos: Existen 20 -amino acidos
(AA) comunes o frecuentes
AA estn unidos por enlaces peptdicos y estn compuestos
de C, N, H, O y S
El % N2 en una protena se encuentra entre el rango de 13.4
a 19.1 %, calculado principalmente por presencia o nmero
de AA bsicos
Proteinas se clasifican en base a:

1. solubilidad

2. estructura

3. funcin
El N en un alimento principalmente proviene de protenas y
NPN

Protena es analizada para,

1. determinar su actividad biolgica

2. investigar sus propiedades funcionales
3. etiquetado nutrimental

Anlisis de Proteina se requiere para conocer,

1. protena total
2. composicin amino acidos
3. cantidad de una protena particular en una mezcla
4. Contenido de protena durante aislamiento y
purificacin
5. Nitrgeno no proteco
6. Valor nutricional de una protena

Mtodos para la Determinacin de Protena

NITRGENO TOTAL

Kjeldahl

Mtodos de pirlisis

ESPECTROFOTO-MTRICOS
Absorcin UV
Mtodo de Infrarrojo

Mtodo de Flourescencia

Determinacin de Protena

OTROS MTODOS

MTODOS Espectro
fotomtricos

Ligado de Tinta

Mtodo de Ninhidrina

Ensayo de Bradford

Mtodo Turbimtrico

Ensayo de Colorante Aninico

Reaccin con Sales de Cobre
Ensayo de Biuret
Ensayo de Lowry
Ensayo del Acido Bicincico

Anlisis de Protena: Determinacin de

contenido de Nitrgeno

Nitrgeno: presente solo en las biomoleculas: proteinas

nicos constituyentes en alimentos y otras biomolculas que
contienen N2 .

Otros compuestos nitrogenados: Clorofila, cidos nucleicos,

algunas vitaminas, lecitinas, urea, amino azucares, alcaloides,
iones amonia, etc.

En promedio, el contenido de proteinas en alimentos:

normalmente es 16%. Por lo que se multiplica contenido de N2
por 6.25 para obtener dicho contenido de protena

Anlisis de protenas en alimentos se lleva

cabo primordialmente mediante la
Determinacin del Contenido de Nitrgeno

El mtodo ms comn y altamente aceptado es la determinacin de

nitrgeno por el Mtodo de Kjeldahl (AOAC Mtodo Referencia
mundial - AOAC)

NITRGENO POR KJELDAHL

Mtodo se basa en la conversin de nitrgeno proteco en

amonio. Al mismo tiempo se libera carbono e hidrgeno
que se oxidan para formar dixido de carbono y agua.

1. En presencia del cido sulfrico, se forma sulfato de

amonio.

2. Posteriormente se adiciona hidrxido de sodio a la

solucin de sulfato de amonio y cido sulfrico. El pH se
incrementa lo que transforma el ion amonio (NH4+) en
amoniaco.

NITRGENO POR KJELDAHL

3. La muestra que contiene nitrgeno, hidrxido de sodio

y sulfato de sodio se calienta, lo que libera el amonio en
forma de gas.

4. El gas amonio puede condensarse cuando es

introducido en un fludo que contiene cido brico e
indicadores de pH. (microKjeldhal)

El amonio reacciona con el cido brico para formar

borato de amonio. El cual es una base.

5. El borato de amonio puede titularse hasta punto final

con cido clorhdrico (debe de conocerse la normalidad
del cido)

Se puede llevar a cabo la digestin utilizando matraces

de micro-Kjeldahl o de macro-Kjeldahl

El matraz de Micro Kjeldahl tiene una capacidad de

10 -30 mL y el de macro Kjeldahl una capacidad de
100 - 800 mL.

NITRGENO POR KJELDAHL

Los moles de HCl = moles NH3 = moles N2 en la

muestra
Como la mayora de las protenas contienen 16% N2, el
factor de correcin 6.25 convierte el % N2 a %
proteina (1/.16)
% N2 * 6.25 = % Protena
% N2/0.16 = % Protena
Desviaciones:
Trigo: 5.70; Leche: 6.38; Gelatina: 5.55
Productos microbianos pueden tener factores tan bajos
como 5.14 hay que utilizar el factor de
multiplicacin/correccin correspondientes.

NITRGENO POR KJELDAHL etapa pirolisis

NITRGENO POR KJELDAHL

destilador Kjeldhal

Reacciones KJELDAHL

Protena + H2SO4 ----------> NH4HSO4

NH4HSO4 + 2 NaOH- ----vapor y calor--------->

NH3(gas) + 2 H2O + Na2SO4

NH3(lq) + H3BO3 -----------------> NH4+ +

H2BO3-

NH4+ + H2BO3- + HCl -----------------> H3BO3 +

NH4Cl (se utilizan como indicadores el azul de
metileno y el rojo de metileno (pH5 punto
final)

ALTERNATIVAS A LA DESTILACIN Y
TITULACIN POR KJELDAHL
1.

NESLERIZACIN = reaccin del amonio con yoduro de mercurio

para producir yoduro di-mercrico de amonio que puede leerse en
un espectrofotmetro (visible @ 440nm)

2.

Reaccin con fenol e hipoclorito para formar indofenol, el cual

puede leerse en el SPEC (visible @ 630nm)

3.

Uso de un electrodo sensible al amonio o anlisis por

cromatografa de iones.

KJELDAHL
Cules son las Ventajas ?
1. Amplio rango de aplicaciones
2. Simple
3. Barato
4. Mtodo Oficial (AOAC)
5.Puede medir mg de protena
Cules son las Desventajas ?
1. Mide N2 total no proteco
2. Toma mucho tiempo mnimo 2 hrs
3. Menos preciso que otros mtodos
4. Corrosivo (peligroso)

Protena - Mtodos
espectroanalticos

Absorcin UV (280 nm)

Absorbancia de una Solucin de acuerdo a la Ley

de Lambert&Beer's:

A=abc
En donde A = Absorbancia
a=constante de absorcin, una constante que es
caracterstica para un compuesto qumico en
particular a una longitud de onda en particular.
b=longitud de la celda en cm.
c=concentracin de la especie qumica en la
solucin.

Mtodo Espectrofotomtricos
Absorcin UV (280 nm)

La mayora de las protenas presentan absorcin a la luz

UV a 280 nm debido a que contienen grupos cromforos
debido a las cadenas laterales de tirosina, triptofno, y
fenilalanina.

Asumiendo que los alimentos contienen proporciones

similares de stos amino acidos la concentracin de
protenas en una solucin clara (verdadera) es proporcional
a la absorbancia.

Absorcin UV (280 nm)

Asumiendo que la concentracin del compuesto en

solucin se encuentra en unidades de Molaridad
(moles/Litro), podemos entonces utilizar el
coeficiente de absorcin molar () en lugar de la
constante de absorbancia. La ecuacin sera entonces:
A=bc
donde est en unidades de L/mol/cm.
La absorbancia molar puede determinarse para
protenas individuales y si las mismas se encuentran
puras (sin otras protenas presentes). Este valor puede
utilizarse para estimar la concentracin de protenas
en una solucin problema.

Absorcin UV (280 nm))

Ventajas
- rpido y sensible
- no destructivo
- no hay interferencia del amonio
Desventajas
- los cidos nucleicos tambin absorben a 280 nm
- la concentracin de TRP y TYR varan en las diferentes
protenas
- problema de turbidez
Aplicaciones del Mtodo? No es aceptado como mtodo
oficial o referencia se usa ms para proceso o
investigacin monitorear la extraccin y separacin de
protenas en lnea proceso Cromatografa de Columna y
de HPLC

La Absorcin de UV (280 nm) puede

correlacionarse con Kjeldahl
Y=8.12 X + 0.104

MTODO DE LOWRY

Mtodo de Lowry es un mtodo

espectrofotomtrico basado en la
formacin de un color azul:

TIROSINA o TRIPTOFANO en la
protena, stos reducen el reactivo de
fosfomolibdeno-fosfotungsteno

Los valores de aborbancia se

determinan en el espetro-fotmetro a
750 nm. Pueden determinarse
cantidades de protena tan bajas como
0.2 g.

MTODO DE LOWRY-Ventajas

Es el mtodo espectrofotomtrico ms sensible

para determinar la concentracin de protena
total. El mtodo es 10 a 20 veces ms sensible
que la absorcin UV a 280 nm
El mtodo es ms especfico que otros y se
comporta mejor bajo condiciones de turbidez
en solucin
El mtodo de Lowry es relativamente rpido,
requiere de 1-2 hras.
Se utiliza mucho en el campo Biomdico

MTODO DE LOWRY-Desventajas

El mtodo requiere de una estandarizacin

cuidadosa (excelente curva de calibracin):
a. La cantidad de color vara para las diferentes
protenas
b. El color no es estrictamente proporcional a la
concentracin
c. La evidencia ms reciente sugiere que azcar,
lpidos, buffers, y hexosaminas reaccionan en
diferentes niveles a la prueba de Lowry.
Desventaja: falta Especificidad
d. Altas concentraciones de sulfato de amonio,
compuestos azufrados y fosfato pueden interferir

MTODO DE LIGADO DE
COLORANTES
Las protenas pueden ligar ciertos tipos de colorantes.

Cuando el colorante se liga, el complejo protena-colorante

precipita.
El colorante no ligado puede determinarse fcilmente por

un mtodo espectro-fotomtrico usando una curva estndar

con diferentes concentraciones de dicha sustancia
colorante.
Conociendo la cantidad de colorante adicionada

inicialmente a la solucin de protena, puede calcularse la

concentracin de protena en solucin.

MTODO DE LIGADO DE COLORANTES

Los grupos catinicos en los aminocidos bsicos:

histidina, arginina, lisina y el amino terminal
reaccionan con el colorante aninico del cido
sulfnico (i.e Negro Amido)

MTODO DE BRADFORD

Utiliza el Colorante Azul Brillante de

Coomassie que se liga a la protena
(cromoforo inducido)
El Colorante cambia de ROJO a AZUL
Mide en el SPEC a 595 nm
Ventajas:
- Rpido, Reproducible, Sensible (ms que
Lowry)
- No interferencia de K, Na, Mg, NH4,
Carbohidratos

ENSAYO DE BRADFORD

Desventajas:
- los detergentes ionicos y no ionicos
interfieren
-no pueden usarse celdas o cubetas de cuarzo
-Variabilidad en la respuesta
Aplicacin: Se utiliza como mtodo rpido de
control de calidad en la industria farmacutica,
bioprocesos en general y alimentos.

Bradford (BioRad)

El color cambia de azul plido a fuerte, despus de la

incubacin. Medicin de absorbancia a 595 nm

MTODO DE BIURET

Protena Soluble - Biuret, Lowry, Acido Bicincnico,

Ligado de Colorantes, Bradford, Ninhidrina

Los iones cpricos reaccionan con los enlaces

peptdicos bajo condiciones alcalinas
Medicin de intensidad de
cromforo en el
SPEC a 540 nm

MTODO DE BIURET
Iones Cpricos reaccionan con los
enlaces peptdicos bajo condiciones
alcalinas
Medir absorbancia en el SPEC a 540 nm

MTODO DE BIURET
Ventajas:
- Barato y ms rpido que el Kjeldahl
- Menos problemas y desviaciones de color que
el mtodo de Lowry
- Menos sustancias interfieren
- NO mide nitrgeno no proteico (NPN)

MTODO DE BIURET
Desventajas:
- Poca sensibilidad: nivel 2-4 mg
- interferencia de pigmentos biliares
-interferencia de sales de amonio
- el color depende del tipo de protena
- los lpidos y carbohidratos pueden afectar la claridad
de la solucin
- LA PROTENA DEBE DE SER SOLUBLE

El reactivo de Biuret forma

un color morado cuando
reacciona con la protena. La
intensidad del color es
proporcional a la cantidad de
protena. Cmo se determina
la cantidad?

Relacin entre la concentracin de protena

y la Absorbancia

Curva
estandard
A = mx + b
m - slope
b - y intercept

MTODO DEL CIDO BICINCNICO (BCA)

Las protenas reducen los iones cpricos a iones cuprosos
bajo condiciones alcalinas. Los iones Cuprosos reaccionan
con el reactivo de BCA para producir un color morado.
Ventajas
- tan sensible como Lowry pero ms simple
- reactivo es ms estable que Lowry
- los detergentes no-inicos no interfieren
- no sufre interferencia de [ ] moderadas de agentes
desnaturalizantes

MTODO DEL CIDO BICINCNICO (BCA)

Desventajas
- el color no es muy estable a travs del tiempo......tiempo
debe de controlarse
- los azcares reductores interfieren ms que en el mtodo de
Lowry
-Variaciones de color con diferentes protenas
-absorbancia vs [ ] no es lineal

El Color cambia de amarillo verdoso a morado

(violeta). La Absorbancia se mide a 562 nm

MTODO DE DUMAS
Mide el Nitrogeno liberado cuando la muestra ha sido
combustionada (800C). El nitrgeno puede medirse
por GC usando un Detector de Conductividad
Trmica (TCD)
ESPECTROSCOPA INFRARROJO

Los enlaces peptdicos en las molculas de protena

causan absorbancia de radiacin en longitudes de
onda de la regin infrarrojo cercano y medio.

Mtodo Ninhidrina
Los grupos amino Primarios
en el amino terminal de las
protenas, pptidos y aminos
libres reaccionan con el
reactivo de ninhidrina.

La reaccin forma un color morado fuerte en

solucin denominado morado de Ruheman.

La hidrlisis alcalina preliminar de las protenas

aumenta la sensibilidad del mtodo por medio del
incremento en el nmero de grupos amino primarios
disponibles para la reaccin.

Ninhidrina

Ventajas
1. Rpido y ms fcil que Kjeldahl
2. La sensibilidad de mtodo es bastante buena.
Desventajas
1. El nivel del deteccin del mtodo no es muy buena. Se
requieren altas concentraciones de protena.
2. Las protenas varan en su capacidad de ligar el
cromforo (las curvas de regresin son necesarias para
un alimento especfico).
3. Los consituteyentes no protecos (calcio y fsforo)
pueden ligarse al colorante o protena. Se pueden
adicionar agentes quelantes como el cido oxlico.

Cmo Seleccionar un
Mtodo de Protena?

Qu es lo que mide?????

N2 Total, que se
convierte en el % de
protena.
Se determina el N2 por
digestin, neutralizacin,
destilacin y titulacin.

Kjeldahl

Cmo Seleccionar un Mtodo de

Protena?

Dumas

Qu es lo que mide??

N total, convertido al % de
protena.
El N se libera por combustin
2
y se mide pro GC utilizando un
detector de conductividad
trmica

Cmo Seleccionar un Mtodo de

Protena?

Qu es lo que
mide?????

Absorbancia s 280 nm (semicuantitativo)

Presencia de tirosina y
triptofno
La absorbancia es relacionada
con la concentracin por medio
de la Ley de Lambert&Beers.

Cmo Seleccionar un
Mtodo de Protena?

Mtodos espectrofotomtricos

Lowry

Bradford

Qu es lo que
mide?????

Reactivo fenlico de FolinCiocalteau

Colorante que cambia de color

cuando se liga a protena

Cmo Seleccionar un
Mtodo para Protena?

Mtodos
espectrofotometricos
Colorante Aninico de
Acido Sulfnico
Biuret

Qu es lo que
mide?????

Colorante que precipita

El enlace peptdico forma un

complejo con iones cpricos bajo
condiciones alcalinas

Cmo Seleccionar un Mtodo para

medir Protena?

Qu es lo que
mide?????

Los enlaces peptdicos causan

absorcin en la regin de
infrarrojo cercano y medio

Rpido-Instrumental ms caro

Espectroscopa Infrarrojo

Seleccionando un mtodo para proteina

AMINOS LIBRES O PROTENA

POR HIDRLISIS

Ninhidrina

Qu es lo que
mide?????

Los grupos aminos

primarios, amonio y
amino cidos
reaccionand con la
ninhidrina y la
hidrindantina para
formar un color
morado

COMPARACIN DE MTODOS

Kjeldahl requiere menos preparacin de la muestra y no

requiere de protena soluble.
Kjeldahl, Biuret, colorante aninico son menos
sensibles que Lowry, UV, BCA, Bradford
Los Estndares (referencia) son importantes para todos
los mtodos menos en el Kjeldahl
Nitrgeno no proteco es un problema en ciertos
mtodos
Los factores para convertir el N2 a protena deben ser
los adecuados