Anda di halaman 1dari 30

Kimia Pemisahan

Kromatografi Kolom

r
g
o
t

a
m
o
m
r lo
K eo
K
lompok 7
K
Nama Kelompok :

1. Ade Nur Badri


2. Lila Nor A
3. Nur Halimah

Kromatografi
Kromatografi merupakan suatu nama yang

diberikan untuk teknik pemisahan tertentu.


Kromatografi pertama kali di perkenalkan oleh
Michael Tsweet pada tahun 1903 yang
merupakan seorang di ahli botani dari rusia.
Dalam percobaannya Michael Tsweet berhasil
memisahkan klorofil dan pigmen pigmen
warna lain dalam ekstrak tumbuhan dengan
menggunakan serbuk kalsium karbonat yang
di isikan ke dalam kolom kaca dan petroleum
eter sebagai pelarut.

Kromatografi
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan

molekul
berdasarkan
perbedaan
pola
pergerakan antara fase gerak dan fase diam
untuk memisahkan komponen (berupa
molekul) yang berada pada larutan.

Pengertian Kromatografi
Kromatografi secara umum.
Teknik
pemisahan

menjadi
Suatu

campuran

Komponen

Kromatografi
adalah
teknik
untuk
memisahkan
campuran
menjadi
komponennya dengan bantuan perbedaan
sifat fisik masing-masing komponen.

Kromatografi Kolom

engertian Kromatografi Kolom


Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi
klasik yang masih banyak digunakan. Kromatografi
kolom digunakan untuk memisahkan senyawasenyawa dalam jumlah yang banyak berdasarkan
adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering
digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3,
dan Diaion.

engertian Kromatografi Kolom


Kromatografi kolom termasuk kromatografi cairan,
adalah metoda pemisahan yang cukup baik untuk sampel
lebih dari 1 gram. Pada kromatografi ini sampel sebagai
lapisan terpisah diletakkan diatas fase diam. Biasanya
sampel dihomogenkan dengan fase diam sehingga
merupakan serbuk kering, diatas lapisan ini dapat
diletakkan pasir untuk menjaga tidak terjadinya kerusakan
waktu ditambahkan fase gerak diatas lapisan sampel.

engertian Kromatografi Kolom

Prinsip Kerja
Kromatografi Kolom
Didasarkan pada absorbsi komponen2 campuran
dengan afinitas berbeda terhadap permukaan fase
diam.
Absorben bertindak sebagai fase diam dan fase
geraknya adalah cairan yang mengalir membawa
komponen campuran sepanjang kolom.
Sampel yang mempunyai afinitas besar terhadap
absorben akan secara selektif tertahan dan
afinitasnya paling kecil akan mengikuti aliran pelarut.

Bentuk Kolom

Alat kromatografi kolom


sederhana, terdiri dari
kolom dari kaca yang
ada kranya. Umumnya
panjang kolom minimum
10x diameter pipa kaca
yang digunakan dan labu
Erlenmeyer sebagai
penampung eluen.

Bahan yang Digunakan

Fasa diam berupa adsorben


yang tidak larut dalam fasa
gerak, ukuran partikel fasa
diam harus seragam.
Adanya pengotor dalam
fasa diam dapat
menyebabkan adsorbsi
tidak reversible. Sebagai
fasa diam digunakan
alumina, silica gel, arang,
bauksit, kalsium karbonant,
bauksit, magnesium
karbonat, pati, talk,
selulose, gula, tanah
diatom. Pengisian fasa
diam ke dalam kolom dapat
dilakukan dengan cara

Bahan yang Digunakan


Pada cara basah fasa diam
dibuat bubur dulu dengan
pelarut yang akan
digunakan untuk fasa
gerak, baru kemudian
dimasukkan kedalam
kolom. Fasa gerak dalam
kromatografi kolom dapat
berupa pelarut tunggal
atau campuran beberapa
pelarut dengan komposisi
tertentu. Pelarut dapat
polar atau non polar
dengan berat molekul kecil
lebih cepat meninggalkan
fasa diam.

Sifat Adsorben dan Pelarut


Harus memiliki luas permukaan besar internal. Kecepatan adsorbsi
akan semakin bertambah dengan semakin kecilnya ukuran diameter
adsorben. Daerah tersebut harus dapat diakses melalui pori-pori
cukup besar untuk mengakui molekul untuk teradsorpsi. Ini adalah
bonus jika pori-pori juga cukup kecil untuk mengecualikan molekul
yang tidak diinginkan untuk menyerap adsorben.
Harus mudah diregenerasi, adsorben seharusnya tidak mengalami
penuaan yang cepat.
Tidak cepat kehilangan kapasitas serap, melalui daur ulang terusmenerus harus adbsorbent mekanik cukup kuat untuk menahan
penanganan massal dan getaran yang merupakan fitur dari setiap unit
industri.

Sifat Adsorben dan Pelarut


Pemilihan pelarut tergantung dari sifat kelarutannya, akan tetapi lebih
baik untuk memilih suatu pelarut yang tidak tergantung pada
kekuatan elusi sehingga zat-zat elusi yang lebih kuat dapat dicoba.
kekuatan dari zat elusi adalah daya penyerapan pada penyerap
dalam kolom.
Adsorbsi terjadi karena adanya perbedaan potensial antara molekulmolekul adsorbat dengan permukaan aktif pada pori-pori adsorbent.
Gaya tersebut yang menyebabkan molekul-molekul adsorbate secara
difusional terjerap ke dalam pori-pori adsorbent, dan terikat untuk
waktu tertentu. Faktor-faktor yang mempengaruhi adsorpsi adalah
jenis adsorbent, jenis adsorbate, konsentrasi adsorbate, luas
permukaan aktif adsorbent, daya larut adsorbent, dan kemungkinan
terjadinya koadsorbsi apabila terdapat lebih dari satu jenis adsorbat.
(Aswad. 2001)

Sifat Adsorben dan Pelarut


Ditambahkan lebih lanjut oleh Hassler; Weber;
Sawyer dalam Zahroh. (2010), proses adsorpsi
dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain:
.
Sifat Adsorbat
Besarnya adsorpsi zat terlarut tergantung pada kelarutannya pada
pelarut. Kenaikan kelarutan menunjukkan ikatan yang kuat
antara zat terlarut dengan pelarut. Apabila adsorbat memiliki
kelarutan yang besar, maka ikatan antara zat terlarut dan pelarut
makin kuat sehingga adsorpsi akan semakin kecil karena
sebelum adsorpsi terjadi diperlukan energi yang besar untuk
memecahkan ikatan zat terlarut dengan pelarut.

Sifat Adsorben dan Pelarut


.
Konsentrasi Adsorbat
Adsorpsi akan meningkat dengan kenaikan konsentrasi
adsorbat. Adsorpsi akan konstan jika terjadi kesetimbangan
antara konsentarasi adsorbat yang terserap dengan konsentrasi
yang tersisa dalam larutan.
.
Sifat Adsorben
Adsorpsi secara umum terjadi pada semua permukaan, namun
besarnya ditentukan oleh luas permukaan adsorben yang
kontak dengan adsorbat. Luas permukaan adsorben sangat
berpengaruh terhadap proses adsorpsi. Adsorpsi merupakan
suatu kejadian permukaan sehingga besarnya adsorpsi
sebanding dengan luas permukaan. Semakin banyak
permukaan yang kontak dengan adsorbat maka akan semakin
besar pula adsorpsi yang terjadi.

Sifat Adsorben dan Pelarut


. Temperatur
Reaksi yang terjadi pada adsorpsi biasanya eksotermis, oleh
karena itu adsorpsi akan besar jika temperatur rendah. Waktu
kontak yang cukup diperlukan untuk mencapai kesetimbangan
adsorpsi. Jika fasa cair berisi adsorben diam, maka difusi
adsorbat melalui permukaan adsorben akan lambat. Oleh karena
itu, diperlukan pengocokan untuk mempercepat proses adsorpsi.
.
pH (Derajat Keasaman)
Untuk asam-asam organik adsorpsi akan meningkat bila pH
diturunkan dengan penambahan asam-asam mineral. Hal ini
disebabkan karena kemampuan asam mineral untuk mengurangi
ionisasi asam organik tersebut, sebaliknya bila pH asam organik
dinaikkan yaitu dengan menambahkan alkali, adsorpsi akan
berkurang sebagai akibat terbentuknya garam.

Cara Kerja Kromatografi Kolom


Metode basah
Adsorben dicampur dengan pelarut, kemudian
campuran
dimasukkan
ke
dalam
kolom.
Keuntungan dari metode ini adalah gelembung
udara dapat dihilangkan dari kolom. Contoh:
kolom diisi dengan pelarut non polar seperti
hekasana kira-kira setengah dai tinggi kolom
gels. Ditimbang sebnyak 8 gram alumina dalam
gelas piala sementara erlenmeyer 125 diisi 15 ml
heksana. Dengan perlahan serbuk alumina
ditambahkan sedikit demi sedikit sambil diaduk.
Gunakan pipet pasteu untuk membuat bubur,
kemudian dengan cepat bubur tersebut dipipet
dan dimasukkan ke dalm kolom. Tempatkan
erlenmeyer di bawh kolom kemudian buka screw

Cara Kerja Kromatografi Kolom


Teruskan penambahan bubur alumina
sampai habis, jangan lupa penambahan
pelarut heksana terus dilakukan dan pelarut
heksan yang keluar dapat ditampung dan
digunakan
kembali
untuk
packing/menambah lagi alumina ke dalam
kolom. Jika packing sudah selesai, screw
clamp ditutup, tinggi cairan minimal sma
dengan tinggi alumina. Kadang-kadang
pasir juga ditmbahkan pda puncak kolom
untuk mencegah dari gangguan saat pelaut
baru ditambahkan.

Cara Kerja Kromatografi Kolom


Metode kering
Metode ini lebih mudah tapi dapat
menimbulkan adanya gelembung udara
dalam kolom. Gelembung udara ini harus
dihindari, karena akan mengurangi resolusi
dari pemisahan. Contoh: Bagian dasar dari
kolom diisi dengan glass woll secukupnya.
Pinch clamp ditutup dan kolom diisi dengan
pelrut. Masukkan 8 gram alumina ke dalam
kolom gelas yang berisi pelarut dan biarkan
pelarut mengalir. Pinch clamp ditutup jika
packing sudah selesai dan tinggi pelarut
minimal sama dengn tinggi alumina.
Demikian juga hindai agar kolom tidak

Cara Kerja Kromatografi Kolom


Pebandingan antara volume total kolom
(cair+padat) dengan diameter kolom yang
optimal agar dipeoleh pemisahan yang baik,
sulit dinyatakan secara tepat dan ini
dilakukan
secara
coba-coba
secara
sistematis. Secara umum, hanya dapat
dinyatakan bahwa kemasan kolom yang
panjang
akan
memberikan
tingkat
pemishan yang tinggi dan kolom yang
lebar adalah baik untuk memisahkan
komponen-komponen dalam jumlah besar.
Jenis fase diam yang digunakan adalah
silika gel dan alumina.

Aplikasi Sampel dan Proses Elusi


Sebelum sampel dimasukkan ke dalam kolom,
pelarut dikeluarkan sedemikian rupa hingga cairan di
atas fase diam hmpir kering. Smpel dimasukkan pada
bagian atas dari fase diam dengan bantuan pipet tetes.
Sejumlah kecil pengelusi (fase gerak) digunakan untuk
mencuci sissa sampel dalam wdah sampel dan
selnjutnya dimsukkan ke dalam kolom.

Aplikasi Sampel dan Proses Elusi


Setelah sampel dimasukkan, biasanya ditambah
lagi eluen sedemikian rupa hingga ketinggian fase
gerak di atas fase diam 5-10 cm. Selanjutnya,
hubungkan dengan wadah fase gerak (proses elusi
dilakukan) dan alirkan pengelusi sedemikin rupa
sehingg

ketinggian

cairan

di

atas

fse

dipertahankan. Proses elusi dilakukan sampai


komponen yang diinginkan keluar dari kolom.

diam

Pengumpulan Fraksi

Pengumpulan fraksi dapat dilakukan secara manual

dengan menggunakan tabung reaksi yang sebelumnya diberi


tanda sesuai dengan volume yang diinginkan atau pada waktu
tertentu yang ditetapkan sebelumnya. Pengumpulan ini dapat
juga dilakukan secara otomatis dengan bantuan kolektor
fraksi. Jika tidak ada prosedur tentang jumlah tiap fraksi yang
harus dikumpulakn maka biasanya diambil pendekatan yakni
2-5% dari volume total (cair+padat).

Manfaat Kromatografi Kolom


Dalam bidang bioteknologi

Kromatografi mempunyai peranan yang


sangat besar. Misalnya dalam penentuan,
baik kualitatif maupun kuantitatif, senyawa
dalam protein. Protein sering dipilih karena
ia sering menjadi obyek molekul yang harus
di-purified (dimurnikan) terutama untuk
keperluan dalam bio-farmasi.

Manfaat Kromatografi Kolom


Dalam bidang bioteknologi

Kromatografi juga bisa diaplikasikan dalam


pemisahan molekul-molekul penting seperti asam
nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul
penting lainnya. Dengan data-data yang didapatkan
dengan menggunakan kromatografi ini, selanjutnya
sebuah produk obat-obatan dapat ditingkatkan
mutunya, dapat dipakai sebagai data awal untuk
menghasilkan jenis obat baru, atau dapat pula
dipakai untuk mengontrol kondisi obat tersebut
sehingga bisa bertahan lama.

Manfaat Kromatografi Kolom


Dalam bidang Klinik

Teknik ini sangat bermanfaat terutama dalam


menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air
liur seorang pasien, dokter dapat mengetahui jenis
penyakit yang sedang diderita pasien tersebut.
Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk
perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui
konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air liurnya.
Demikian halnya air kencing, darah dan fluida badan
lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat
sehingga keberadaan suatu penyakit dalam tubuh
manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat.

Manfaat Kromatografi Kolom


Dalam bidang Klinik

Sekarang ini, deteksi senyawa oksalat dalam air


kencing menjadi sangat penting terutama bagi
pasien kidney stones (batu ginjal). Banyak metode
analisis seperti spektrofotometri, manganometri,
atau lainnya, akan tetapi semuanya membutuhkan
kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk
mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan
teknik kromatografi

Kelebihan dan Kekurangan


Kromatografi Kolom
Kelebihan
kolom

Dapat

kromatografi

digunakan

untuk

Kekurangan kromatografi kolom

Untuk

mempersiapkan

analisis dan aplikasi preparative.

kolom dibutuhkan kemampuan

Digunakan untuk menentukan

teknik dan manual. Metode ini

jumlah komponen campuran.

sangat

Digunakan untuk memisahkan


dan purifikasi substansi.

membutuhkan

waktu

yang lama (time consuming).

a
g
o

u
s

m
e
SSelamat bel
ajar
Terimakasih