CURSO PR CONGRESSO: Citometria de fluxo

DOENAS LINFOPROLIFERATIVAS
CRNICAS
Dr. Joo Carlos de Campos Guerra
Departamento de Patologia Clnica - HIAE
Centro de Hematologia de So Paulo - CHSP

CLASSIFICAO REAL/ WHO (98)

Revised European Classification of Lymphomas
and World Health Organization

ENTIDADES (LEUCEMIA / LINFOMA)

BASEADAS EM DADOS:

CLNICOS
MORFOLGICOS

SP, MO, BMO, Bipsia de outros tecidos

IMUNOLGICOS
Imunofenotipagem por citometria de fluxo
Imunocitoqumica / Imunohistoqumica

CITOGENTICOS (FISH ) e MOLECULARES (PCR)

Anormalidades genticas com valor prognstico

NEOPLASIAS DE CLULA B

PRECURSORAS:
Leuc. / Linf. Linfoblstico de Clula B Precursora
PERIFRICAS:
LLC cel-B / Linf. de Pequenos Linfcitos
Leucemia Pr - Linfoctica de Clula B
Linfoma linfoplasmocitide / Imunocitoma
Linfoma de clulas do manto
Linfoma de centro folicular / folicular
Linf. B da Z. M. / esplnico / extranodal (tipo MALT) / nodal
Tricoleucemia ; Plasmocitoma ; Mieloma Mltiplo
Linfoma de Grandes Clulas B Difuso
Subtipos: Mediastinal (tmico) e Intravascular
Linfoma de Burkitt

NEOPLASIAS DE CLULA T e NK

T PRECURSORAS :
Leucemia / Linfoma Linfoblstico T precursora
T e NK PERIFRICAS:

LLC de clula T e Leucemia Pr -Linfoctica

Leucemia de Linfcitos Grandes Granulares
Leucemia Tipo clula T e Tipo clula NK
Micose Fungide e Sndrome de Szary
Linfoma de Clula T perifrica No Especificado
Doenas Linfoprolif. Cutneas Prim. Cell T CD30+
Linfoma de Clula T / Hepatoesplnico
Linfoma de Clula T Tipo Paniculite Subcutnea
Linfoma de Clula T Angioimunoblstico
Linfoma de Clula T Intest.(assoc.ou no a enteropatia)
Leucemia/ Linfoma de Clulas T do Adulto, HTLV1+
Linf.Grandes Clulas Anaplsico, CD 30+, Tipos T e Nula
Linfoma de Grandes Clulas Anaplsico, Tipo Hodgkin (REAL: provisrio)

Gerao e maturao de clulas B

Pr-B

Pr-B

B
Imatura

B Nave

IgM

Centroblasto Centrcito

Clula
do plasma

IgM

Memria
B
IgD

DH-JH

VH-DHJH

VL-JL

Medula ssea
Adpatado de Flix Reyes durante o EHA 2003 em Lyon, Frana, 12-15 de Junho

Mutaes somticas

Linfonodo

Mudana

Maturao das clulas B normais e

expresso do CD20
Clula
tronco

Clula
pr-pr B

TDT

Clula
pr-B

Clula
pr-B

Clula
pr-B

Clula B
imatura

Clula
B madura Clula
PlasmB ativada
cito

CD 19

CD 20 CD 22

CD 38
CD 21

Expresso antignica na
linhagem de clulas-B doentes
LLA

LLC, LLPC
Burkitt, LF, LDGC, TL

Clula
tronco

Pr-B

MW

MM

B precoce B Intermediria B- Madura B Plasmacitide Plasmcito

CD5
CD19
CD20
CD22
CD52

Doenas Linfoproliferativas crnicas

CITOMETRIA DE FLUXO

Determinao da linhagem das clulas

malignas
Deteco de clonalidade
Anlise da maturao celular e
heterogeneidade dentro das populaes
celulares malignas
Avaliao da expresso antignica

LEUCEMIA LINFIDE CRNICA

LLC-B a mais comum leucemia nos EUA.
Incidncia : 27 casos por 100.000 hab./ano 40% leucemia > 65 anos
sia e Japo a incidncia mais baixa, sendo inexplicvel essa observao.
de 20-30x mais comum na Europa, Austrlia e Norte Amrica
Os pacientes com LLC comumente tem mais de 50 anos,
com idade mdia de 65 anos. Rara <30 anos. 20-30% ~ 55 anos
Incidncia homem/mulher de 2:1,
No estadiamento de Ra :
Bom prognstico: score 0, Intermedirio :I e II e
Pobre prognstico :III e IV.

CARACTERSTICAS LABORATORIAIS NO
DIAGNSTICO DA LLC-B
Linfocitose perifrica > 5.000/mm3
Linfocitose >30% na medula ssea
Imunoglobulina de superfcie monoclonal de intensidade baixa
comumente IgM e Kappa (62%), Lambda (2%), CD19 (70%),
CD20 (71%), HLA-DR (70%). CD19 ou CD20 / CD5 e
CD23 (+).

Marcadores T: CD3 (24%), CD5 (93%), CD7(28%).

Marcador de moncitos: CD14(5%).
Resultados negativos para CD10 (Linfoma Folicular)
FMC-7 (LPL), CD25/CD103 (Hairy cell) antgenos de clula T,
outros que no CD5 (neoplasia de clula T), CD79B e CD22
Rearranjo gnico de imunoglobulina (+)
Estudo citogentico: usualmente normal; trissomia do 12
relativamente especfica.

Figura 1: LLC-B (Linfcitos maduros, Sombras celulares de Gun Precht e Prolinfcito)

LEUCEMIA LINFIDE CRNICA-SP

LEUCEMIA LINFIDE CRNICA

Figura 3: Histogramas caractersticos da LLC-B: Clulas linfides B com

restrio de cadeia kappa (baixa expresso) e expresso antignica de
CD5+ e CD20+ (baixa expresso).
76,9% de clulas CD19 (+)

CD19/Kappa +
Kappa de B.Ex

CD19/CD5 +

Sistema de Escore para

diagnstico da LLC
Marcados

1 ponto

0 ponto

SmgI

fraca

forte

CD5

positivo

negativo

CD23

positivo

negativo

FMC7

negativo

positivo

CD22 ou CD79b

fraco

forte

Escores em LLC so geralmente >3, nas outras doenas clulas B so geralmente <3.

Fatores prognsticos em LLC

Fator

Baixo risco

Alto risco

Gnero

Estgio clnico

Binet A/Rai 0-1

Binet B/C Rai II/III/IV

morfologia

tpico

atpico

BMO

No-difusa

difusa

Tempo de duplicao
linfcito

> 12 meses

< 12 meses

Marcadores sricos

normais

aumentados

Expresso CD38

<20-30%

> 20-30%

citogentica

Ausente/del13q

Del 11q23
perda/mutao p53
trissomia do 12 e
alterao 14q

IgVH mutao

mutado

No mutado

Figura : LLC com anormalidade citogentica: Trissomia do 12 por caritipo

convencional e hibridizao in situ por fluorescncia (FISH).

Figura 2: A Sndrome de Richter (5-10%) a transformao da LLC em um

Linfoma difuso de grandes clulas.
Histologia da medula ssea
Infiltrado intersticial e nodular de clulas linfides maduras, intermediadas
por clulas hematopoticas normais. No caso de infiltrao difusa macia
associa-se o quadro com um pior prognstico.
A infiltrao paratrabecular no normalmente observada na LLC.

LEUCEMIA PRLINFOCTICA
LPL pode ser de novo ou secundria a LLC.
A definio de LPL:
> 55% de prlinfocitos no S.P.
LLC/LPL : 10% a 55%
LLC < 10%

A freqncia de LPL de 10% em relao as LLCs.

Mdia de idade: 70 anos
Presena de esplenomegalia volumosa, raramente hepatomegalia e adenomegalia.
Na LPL-T a linfoadenomegalia vista em 50% dos casos e
hepatomegalia em 40%, infiltrao de pele em 27% dos pacientes. A meningite
leucmica tem sido relatada, com tratamento intratecal eficaz.
comum a doena em estgio avanado (Ra IV ou Binet C).
A mdia de sobrevida da LPL de 2 a 3 anos, comparado com 8
anos de LLC. Curso clnico varivel. Anemia e trombocitopenia
Relacionado com sobrevida curta.
Pacientes com LPL-T apresentam mdia de sobrevida de
7 a 7,5 meses, e raramente sobrevivem por 2 anos.

DIAGNSTICO LABORATORIAL DA LEUCEMIA PRLINFOCTICA

1. Leucometria > 100.000/mm3
2. Prlinfcitos >55% no sangue perifrico
3. Em Citometria de Fluxo linfcitos grandes com
fluorescncia intensa
4. Ig de superfcie monoclonal, mais comum IgM - kappa
5. LPL-B: Positivo: CD19,CD20,CD22,FMC-7,HLA-DR e
Negativo: TdT,CD10,CD5 (2/3)
6. LPL-T: TdT-,CD2+,CD3+,CD5+,CD7+,CD4+/CD8- (55-64%)
CD4+/CD8+ (21-30%), CD4-/CD8+ (10-13%)
7. Rearranjo gnico de imunoglobulina na LPL-B
8. Rearranjo gnico de receptor de clula T na LPL-T
1. Anormalidades citogenticas: 14q+ para LPL-B,
inv(14)(q11q32), t(14;14)(q11;q32) e trissomia 8q para LPL-T.
25% do pct t(11;14)(q13;q32) Linfoma do manto- evoluo leucmica
nestes pacientes?

Figura 6: LPL: O nuclolo nico e proeminente

caracterstico do prlinfocito.

COMPARAO ENTRE LLC, LLC/LPL, LPL

LLC

LLC/LPL

LPL

Leuccitos (x109)

10-120

intermedirio

>100

Pro linfcitos (%)

<10

10-55

>55

Infiltrao esplnica

infreq.

intermedirio

presente

Adenomegalias

freq

intermedirio

raro

Ig de superfcie

fraca

bifsica

intensa

CD 5 (+)

pres.

bifsica

<30%

FMC-7 (+)

<20%

<20%

presente

Anorm.Citogenticas

trissomia 12

trissomia 12

14q+

LEUCEMIA LINFOCTICA CRONICA DE LINHAGEM T

LLC-T rara, sendo 1% a 2% das LLC.
A Leucemia de clulas T um grupo heterogneo de doenas:
- Leucemia/Linfoma da clula T do Adulto (LLTA)
- Doena de Linfcitos Grandes Granulares (LGLD)
ou tambm chamada de Doena Linfoproliferativa T- Gamma
- Leucemia Prlinfoctica de clula T (LPL-T)
O grupo britnico acredita que a LLC-T uma variante da LPL-T pela
similaridade clnica, gentica e pela microscopia eletrnica (nuclolo).
O grupo da Clnica Mayo classifica junto com a LLC-B pela morfologia.
Na classificao Americana/Europia de Linfoma est em estudo
e na Organizao Mundial da Sade (WHO) foi excluda, como entidade
separada.

DIAGNSTICO LABORATORIAL DE LLC-T

Linfocitose > 5.000/mm3
Clulas leucmicas: predomnio de linfcitos maduros
Linfocitose de medula ssea > 30%
Expresso de um ou mais antgenos T: CD2, CD3, CD5, CD7
Fentipo mais freqente : CD4(+)
Rearranjo gnico: TCR
Citogentica: t(14:14)(q11;q32), inv (14;14)(q11;32)
TdT e CD1 : negativos

Figura 5: LLC-T / LPL-T: Linfcitos pequenos com alta relao N/C, ncleo
redondo, nuclolo pequeno ou ausente. Ausncia de grnulos no citoplasma.

LEUCEMIA DE CLULAS CABELUDAS - (HAIRY CELL LEUKEMIA)

A incidncia de HCL de 2% do total das leucemias

Seu diagnstico essencial pela possibilidadae de cura
Linfocitose de longo tempo, hepatoesplenomegalia e trs punes
secas.
Anemia 85%, trombocitopenia 60 - 80% e leucopenia 60%

DIAGNSTICO LABORATORIAL DE HAIRY CELL LEUKEMIA

1. Clulas leucmicas com projees citoplasmticas finas
2. Pancitopenia com monocitopenia
3. TRAP positivo
4. Imunofentipo Positivo para: CD11c, CD22, CD25,
FMC-7 e CD103
Imunohistoquimica: DBA-44 (+)
Imunoglobulina de superfcie monoclonal
Caractersticas histolgicas: Medula ssea com aspecto de
ovo frito, favo de mel
Formao de pseudosinus em bao
Leso angiomatosa em fgado
1. Microscopia Eletrnica : Projees citoplasmticas finas e
complexo ribossomo-lamela
9. Rearranjo gnico de imunoglobulina

Leucemia das Clulas Cabeludas / Tricoleucemia: Clulas de hairy cell

com as delicadas projees citoplasmticas em toda superfcie celular.

Anlise da Hairy cell Leukemia por Citometria de Fluxo

Histograma Volume x Granularidade

Histograma CD19 x Granularidade

Hairy cell
Hairy cell

Linfocitos B

Linfocitos B

SISTEMA DE ESCORE PARA LLC

Doena

CD5
escores

CD23

CD79b

Diferente do anterior em relao

Ao CD22(-) / CD79b = 1 ponto

FMC7

sIg

LLC (escore)

+ (1)

+ (1)

-/w (1)

-/w (1)

W (1)

4-5

LPL-B

+/-

0-1

HCL

-/+

+/-

0-1

LCM

+/-

1-2

LF

-/+

0-1

LEZM

-/+

0-1

CD79b - parte do receptor de antgeno da clula B; CD22 pode ser usado

FMC7 - liga-se a um epitopo na conformao do CD20. CD20 de baixa intensidade na LLC, porm
FMC7 melhor para o sistema de escore

Catovsky D. Hematol Oncol Clin N Am 2004; 18:783-794

LINFOMA E LEUCEMIA DA CLULA T DO ADULTO

O HTLV-1 pode ser transmitido sexualmente, transfuso sangunea
e aleitamento materno. A transmisso requer a transferncia das clulas
infectadas, no se transmitindo o vrus livre.

CARACTERSTICAS LABORATORIAIS DO ATCL:

Presena de anticorpos contra o HTVL - I

Fentipo de clulas T monoclonais
Positivo para CD2, CD3, CD4, CD5 e CD25
Negativo para TdT, CD7, CD8 e CD1
Identificao da presena do genoma pr-viral do HTLV-I por
Southern blotting ou PCR
Isolamento do vrus HTLV-1
Hipercalcemia

Linfoma/Leucemia da Clula T do Adulto: Clulas polilobuladas

(flower cell) com citoplasma fracamente basoflico.
A cromatina nuclear pouco condensada, raramente nuclolos.
O citoplasma moderadamente basoflico.
Na forma aguda comum um grande nmero de linfcitos atpicos no S.P. e
as clulas variam de tamanho e forma.
Na forma crnica as clulas tumorais so uniformes em tamanho,
tendo menor porcentual do que a forma aguda.

LINFOMA NO - HODGKIN
gg linfticos adenomegalia
proliferao clonal T, B, cells retics
LNH-B so os mais freqentes
sintomas B: 20% dos casos
freqentemente extranodal

AGENTES ETIOLGICOS
Predisposio individual
Imunodeficincia ou estimulao
Radiaes ionizantes / subst txicas
Infeco viral
Alterao citogentica
Transplante de rgos

AGENTES INFECCIOSOS
ENVOLVIDOS COM OS LNH
Burkitt ..................EBV e MALRIA
L. T/NK nasal......Vrus Epstein-Barr
L. MALT gstrico................H.pylori
L. / Leucemia cel -T....HTLV-I (adulto)

DIAGNSTICO CLNICO
Adenomegalia superficial ou
Cadeias ganglionares profundas
Hepato e esplenomegalia (freq)
Tumoraes em outros rgos e
tecidos (ossos, pele, glndulas, SNC
(extranodais)

DIAGNSTICO CLNICO
Fraqueza, febre
Emagrecimento e palidez
Hemorragias no so freqentes
tumoral em ossos e nervos
sintomas neurolgicos
Infiltrao do tecido cutneo

DIAGNSTICO LABORATORIAL
HEMOGRAMA
Citopenias: I.M.O.
Leucocitose
(LLBDD ~ LLC)
Grandes clulas
(leucossarcoma)
BIPSIA GG
Do maior gnglio
Cervical e axilar
Inguinal s se bem
patolgico

MIELOGRAMA
Pode ser normal
Freqente infiltrao
BIPSIA M.O.
Clulas agrupadas (como
ndulos normais)
Infiltrao pode ser de
forma difusa no
parnquima medular

IMUNOFENOTIPAGEM
Citometria de Fluxo: SP,MO,gg
Clone de clulas B:
CD10, CD19, CD20,CD22, CD23
Clone de clulas T:
CD2, CD3, CD5,CD7, CD4, CD8

TRANSLOCAES CROMOSSMICAS
neoplasias de clula B
NEOPLASIA
Burkitt
MALT

Transloc. Gene Envolv.

Conseq.
t(8;14)
c-myc e IgH ativ c-myc
t(11;18)
AP12 e mlt
apoptose
t(1;14)
bcl-10
+ agressiva
FOLICULAR
t(14;18)
IgH e bcl-2
ativ bcl-2
MANTO
t(11;14)
bcl-1 e IgH ativ bcl-1/ciclD1
Gds Cells B Dif. t(3;14) bcl-6 Da extranod. Melhor prog.

TRANSLOCAES CROMOSSMICAS
neoplasias de clula T
NEOPLASIA
L.linfoblstico

transloc.
t(1;14)

LGC. Anaplsico t(2;5)

Gene Envolv.
tal-1/SCL
e a-TCR

ALK e NPM

Conseq.

transcrio
hematopoitica

formao de
tirosina-quinase
NPM-ALK hbrida

ESTADIAMENTO CLNICO
Tratamento, prognstico, comparao

Hemograma, DHL, 2-microglobulina

Sorologias: HTLV I e II, EBV
B.M.O., bipsia ganglionar
Diagnsticos por imagem
Cintilografia com Glio

ESTADIAMENTO CLNICO
DE ANN ARBOR - 1971
I: 1 regio nodal (R.N.):(I); ou de 1 rgo ou local extra-nodal
(EN): (IE).
II: 2 R.N., mesmo lado do diafragma (II) ou envolv. localizado
de 1 rgo ou local E.N. e 1 ou + R.N. do mesmo lado do
diafragma (IIE)
III: envolv. R.N. em ambos os lados do diafragma (III) que se
podem acompanhar de leso no bao (IIIS), de local E.N. (IIIE)
ou ambos (IIISE).
IV: doena disseminada em um ou mais rgos ou tecidos
E.N., com ou sem de gg linfticos.

ndice Prognstico Internacional

A . Pacientes de todas as idades

Risco Relativo

IDADE
< 60 anos x > 60 anos
1.96
DHL
< normal x > normal
1.85
Estado Clnico
0.1 x 2-4
1.80
Estadio (Ann Arbor) I/II x III/IV
1.47
Envolvimento extra-nodal <1stio x >1 1.48
B. Pacientes com menos de 60 anos

Estadio (Ann Arbor) I/II x III/IV

DHL
< normal x > normal
Estado Clnico
0.1 x 2-4

2.17
1.95
1.81

CLASSIFICAO DOS LNH

Baseada na bipsia tecidual
Caractersticas imunolgicas

Caractersticas citogenticas - moleculares

Freqncia dos LNH

LGCBD
30,6%
FOLICULAR 22,1%
Clulas B Z. Marginal, MALT
7,6%
Clulas T Perifricas
7,0%
Pequenos Linfcitos B
6,7%
Clula do Manto
6,0%
LGCB do mediastino
2,4%
Linfoblstico de cl T Precurs. 1,7%
lLinfoplasmocitide
1,2%
Burkitt, Micose Fungide
< 1%
Outros tipos
6,1%

LINFOMA DE GRANDES
CLULAS B DIFUSO

LGCB CLULAS NO CLIVADAS

LGCBD

LINFOMA DE GRANDES
CLULAS B - SP

LINFOMA FOLICULAR, difuso

de pequenas clulas clivadas
Adultos com idade superior a 50 anos
IFT: CD20+,CD10 +/-, CD23+/-, CD43-, CD5-,
ciclina D1 EUA: 40% de todos os linfomas
> representante dos indolentes: 70%
Kiel: Centroccito-Centroblstico
Padro de crescimento folicular
OMS: I e II (peq. e grandes clulas)

LINFOMA FOLICULAR

A estrutura folicular neoplsica contm clulas dendrticas.

LINFOMA FOLICULAR

LINFOMA FOLICULAR

LINFOMA FOLICULAR

PEQUENAS CLULAS CLIVADAS

LINFOMA FOLICULAR

Prevalncia do rearranjo do
gene bcl-2 em LNH
35%
t(14;18)+
85%
t(14;18)+

Linfoma Folicular

Linfoma difuso
de grandes clulas

Le Beau MM. Semin Oncol. 1990;17:20-29

Longo DL, DeVita VT Jr, et al. Cancer Principies & Practice of Oncology. 1993

Colorao Bcl-2
Negativo

Positivo

LNH FOLICULAR DE PEQUENAS

CLULAS CLIVADAS

LNH FOLICULAR DE PEQUENAS

CLULAS CLIVADAS

LNH DE PEQUENAS E GRANDES

CLULAS B

LINFOMAS MALT :
Associados s mucosas
Podem acometer todo o TGI
Tireide
Aparelho respiratrio e uro-genital
De baixo ou alto grau
Sempre de linfcitos B
Bom prognstico (demoram diversos anos
para infiltrar outros rgos)

Linfoma MALT Ocular

CD 20 +

Linfoma MALT Gstrico

LINFOMA DE PEQUENAS
CLULAS DIFUSO

LINFOMA LINFOBLSTICO

Ncleo redondo ou oval e cromatina fina e dispersa. Os nuclolos

apresentam-se de 1 3 e h pouco citoplasma.

LINFOMA LINFOBLSTICO - T

PADRO CELULAR CONVOLUTO

LINFOMA DE BURKITT
LNH-B de alto grau
Relacionado ao EBV
Raramente tem incio em linfonodos
Mitoses abundantes / Padro celular de
cu estrelado
Imuno-histoqumica com anticorpo anti EBV
mostrando moderada imunorreatividade nuclear

LINFOMA DE BURKITT

Linfoblastos com membrana nuclear proeminente e macrfagos

dando aspecto de cu estrelado.

LINFOMA CENTROCTICO CENTROBLSTICO

LNH mais freqente
LNH-B, de baixo grau
Acomete preferencialmente idosos
Padro folicular e/ou difuso
Mitoses raras
Duas populaes linfocitrias

LINFOMA CENTROCTICO CENTROBLSTICO

PEQUENAS E GRANDES CLULAS

MICOSE FUNGIDE
LNH cutneo de clulas T CD4+
LNH de baixo grau (mitoses raras)
Relacionada com o HTLV I e II
Leucemizao: 25% (S.de Szary)
Padro difuso de infiltrao da derme e
epiderme por linfcitos com ncleo
convoluto,cerebriforme

Micose Fungide / Sndrome de Szary:

Ncleo cerebriforme com alta relao N/C.

Imunofentipo
As clulas de Szary so positivas para CD2, CD3, CD4 e CD5 e
caracteristicamente negativas para CD7, CD8 , CD1 e TdT.

LINFOMA HISTIOCTICO

Clulas neoplsicas grandes, com ncleos redondos ou ovais com

citoplasma abundante.

Linfoma Imunoblstico

LINFOMAS DE BAIXO GRAU

Evoluo lenta , apesar do tto
ndice mittico baixo
Sem RC, mesmo com tto precoce e
adequado
Tratamento: prolongamento e
melhoria da qualidade de vida

LINFOMAS DE ALTO GRAU

Evoluo rpida sem tratamento

(meses)
ndice mittico alto
Bom prognstico com tto precoce e
adequado
TTO-alvo: clulas em proliferao
RC (cura): pode ser alcanada