Técnicas Laboratoriais para

detecção de antígenos-anticorpos
 INTERAÇÕES
ANTÍGENO-ANTICORPO

Detecção, quantificação e
caracterização dos
anticorpos e seu uso como
ferramenta para pesquisa e
diagnóstico
RESPOSTA DE ANTICORPOS
 Especificidade
Habilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag.
 Quantidade
N° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua produção.
 Isotipo
Determina a persistência (meia vida in vivo diferente).
A composição determina a função dos Ac e os locais onde são
encontrados.
 Afinidade
Força de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior a
afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário.
 Avidez: força total de ligação, nos dois sítios.
Avidez x Afinidade
MÉTODOS

1) Reagentes não marcados

• Reação de precipitação
• Reação de aglutinação

2) Reagentes marcados
• RIA
• ELISA
• Imunofluorescência
• Western Blotting
MÉTODOS
 PRECIPITAÇÃO APLICAÇÕES
- Imunodifusão dupla
- Imunodifusão radial
- Imunoeletroforese
- Pesquisa
 AGLUTINAÇÃO
- Aglutinação direta e indireta
- Diagnóstico
- Inibição da aglutinação - Soroepidemiologia
- Teste de Coombs
 IMUNOENSAIOS
- RIA
- ELISA
- Imunofluorescência e Citometria de Fluxo
- Western Blotting
PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
 Precipitação:
Formação de complexos Antígeno-Anticorpo.

 Aglutinação:
É o agrupamento de partículas, usualmente por
moléculas de anticorpo que se ligam a antígeno na
superfície de partículas adjacentes.

As reações de precipitação e de aglutinação

decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag
solúvel e particulado.
REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
 Interação entre Anticorpo e Antígeno solúvel
 Anticorpo precisa ser bivalente
 Antígeno precisa ser bi ou polivalente
 A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação
que cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA

PRECIPITADO
 É importante levar-se em conta como ocorre a
ligação Ag-Ac em diferentes concentrações
dos mesmos. Observe abaixo:

Anticorpo livre + - -
Antígeno livre - - +

100%--
Percentual
de

complexo
imune

precipitado Zona de excesso Zona de Zona de excesso

de anticorpo equivalência de antígeno

Quantidade de antígeno adicionado

TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL

IMUNODIFUSÃO
Imunodifusão Dupla:
• Coloca-se agarose sobre uma lâmina:

• Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as

soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo:

Ac
IMUNODIFUSÃO DUPLA
 As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se
encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela
formação de uma linha de precipitação:
 Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das
proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com
corante
Utilização: muito usada em
pesquisa e diagnóstico de
algumas doenças, como
Ag Ag cisticercose

Ac

Ag Ag Ag Ag

Ac Ac

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IMUNODIFUSÃO RADIAL
 Permite a quantificação do
antígeno ou do anticorpo.
 O processo continua até ser
atingida a zona de equivalência,
com os complexos
precipitando-se em um anel
(halo) em torno do orifício.

Utilização: dosagem
Poços onde são
de IgG, IgA e IgM e
colocados padrões
proteínas séricas.
e amostras a serem
dosados
Agarose
contendo
anticorpos Halo
IgGde precipitação
– anti-IgG
anti-IgG humana
IMUNOELETROFORESE
 Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de
agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.
 As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus
PM e cargas elétricas.
 Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde.
 Ag e Ac formam arcos de precipitação.

1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna

canaleta

Ag
canaleta
+ -
Ag

3- Difusão e precipitação

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REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
 Ac + Ag multivalente particulado
 Título: maior diluição que ainda causa aglutinação
(semi-quantitativo)
 Pó-zona: excesso de Ac
 Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga
elétrica (repulsão)
 Agregação visível de
partículas = Eritrócitos,
bactérias, fungos e látex
AGLUTINAÇÃO DIRETA
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação

Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)

1) Amostra de sangue na placa teste:

2) Reagente (anticorpo anti A, B):

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AGLUTINAÇÃO DIRETA
4) Mistura-se:

3) Controle negativo:

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AGLUTINAÇÃO DIRETA

5) Leitura do resultado:

negativo positivo

Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação

visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como
ilustrado acima.

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AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)
Ag solúveis associados a outras superfícies
(Partículas de látex ou superfície de hemácias)

Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de

Chagas:
• As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação
covalente) e então distribuídas nos poços da placa.

• O soro teste e os controles positivos e negativos,

devidamente diluídos, são adicionados aos poços da
referida placa.

• Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se

aglutinam e formam uma camada no fundo do poço.
Quando não existe Ac específico, as células formam um
botão no fundo do poço.
Aglutinação Positiva
Negativa
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)

+ Resultado negativo:
Urina (ausência de hCG na
Soro anti - hCG
urina).
Adicionam-se Partículas Ocorre aglutinação,
revestidas com hCG pois os anticorpos
São incubados e
colocados numa
anti-hCG não são
placa bloqueados na
incubação inicial,
porque não havia o
hormônio na urina.
Resultado positivo:
(presença de hCG
Livres, podem
na urina): não ocorre aglutinar as partículas
aglutinação. revestidas de hCG.

Ac se ligaram no hCG da urina,

(ficando bloqueados), na incubação inicial

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TESTE DE
COOMBS
 Ac antiimunoglobulinas (Robert
Coombs);
 DHRN – mãe produz IgG anti-Rh;
 Não aglutinam os eritrócitos;
 Direto: Ac ligados aos
eritrócitos fetais;
 Indireto: Ac anti-Rh não
aglutinantes no soro materno.
 Permite detectar
incompatibilidades Rh, prevenindo
contra DHRN.
IMUNOENSAIOS
 Reagentes marcados (enzimas,
fluorocromos, isótopos)
 Tipos:
- RIA
- ELISA
- IFA / CITOMETRIA DE FLUXO
- WESTERN BLOTTING
IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
Princípio da técnica:

 Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente)

a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por
radiações UV, emite luz no espectro visível.
 Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo
conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e
vice-versa.
 A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas
que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV
(microscópio de fluorescência).
 Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína –
FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT).
Tipos: direta, indireta ou saduíche.
Microscópio de fluorescência com epiluminação

fluorescência emitida
luz UV atinge o ma- chega ao observador
terial examinado
TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
APLICAÇÃO DA TÉCNICA
IFA direta:
Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em
cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.

IFA indireta:
Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de
Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes.

É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescência é mais

intensa) e especificidade.
 Ensaio Imunoadsorvente
Ligado à Enzima - ELISA
 O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois
conjugados com enzimas.

Fosfatase alcalina
Peroxidase
B-galactosidase
 O produto final corado surge por ação da enzima que converte
um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato
alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância
indicadora).
 A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através
de leitura em fotocolorímetro.
 Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e
captura.
TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto

INDIRETO DIRETO OU PLACA

SANDUÍCHE UTILIZADA
 ELISA Indireto

ELISA Direto ou Sanduíche

 ELISA Competitivo

 Aplicações do ELISA:
 Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa

 Vantagens:
 Teste de alta sensibilidade
 Permite quantificar Ag ou Ac das amostras
 Seguros e de baixo custo
RADIOIMUNOENSAIO - RIA
 Marcações:
 I125: emite raios gama
 H3: raios beta
 Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g)
 Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo.
 Aplicações:
Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios,
proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa
WESTERN BLOTTING
 Eletroforese de
proteínas.
 Identifica
antígenos ou
anticorpos.
WESTERN BLOTTING
WESTERN BLOTTING