Cromatografa

Cromatografa

Cromatografa

Cromatografa

Cromatografa

Descubridor
El botnico ruso Mikhail Tswett (Mikhail
Semenovich Tsvett, 1872-1919)

Definicin
Cromatografa
es
un
mtodo
de
separacin en el que se aprovechan las
diferencias en el comportamiento de
particin entre una fase mvil y una fase
estacionaria para separa los componentes
de una mezcla.

Cromatografa, definicin (cont.)

Una columna u otro soporte mantienen a
la fase estacionaria y la fase mvil acarrea
a la muestra.
Los componentes de la muestra que
particionan fuertemente con la fase
estacionaria estarn ms tiempo dentro
de la columna.

Si es en columna :
Conforme los componentes son eluidos
de la columna, pueden ser cuantificados
por un detector y colectados para anlisis
posterior

Mtodos cromatogrficos

De gases
En capa fina
En lquidos inmovilizados
De exclusin molecular
Intercambio inico
Hidroxiapatita
Hidrofbica
Afinidad
HPLC

Exclusin molecular
Fase estacionaria:
Dextrn con enlaces cruzados
Agarosa con enlaces cruzado
Poliacrilamida

Las molculas grandes fluyen ms

rpido que las pequeas.

Desarrollo de una cromatografa

de exclusin molecular
Determinacin del tamao de
columna
Hidratacin y lavado de la resina
Empaque de la columna
Determinacin del volumen vaco
Corrimiento de la muestra

la

Cromatograma de exclusin
molecular (EM)

Elusin de una columna de cromatografa de EM

Cromatografa de exclusin

Caractersticas de las resinas

de EM clsicas
Nombre
BioGel

Sephadex

Cdigo
P-60
P-100
P-200
P-300
G-50
G-100
G-150
G-200

Rango de
Fraccionamiento
(kDa)

Flujo mximo
(cm/hr)

3-60
5-100
30-200
60-300
2-30
4-150
5-300
5-600

5
5
4
3
5
5
3
2

Intercambio inico

Intercambio inico
Las protenas difieren mucho en su afinidad
por materiales
cargados positiva o
negativamente.
Los soportes pueden ser:
Dextrn con enlaces cruzados
Agarosa con enlaces cruzado
Poliacrilamida
Celulosa
Poliestireno
Slice

Grupos intercambiadores
Fosfato (P)

PO3-

Carboximetilo (CM)

CH2 COO-

Dietilaminoetil (DEAE)
Mono Q

+
(CH2)2NH

CH2 N+ (CH3)3

CH2 CH3

CH2 CH3

Principios del intercambio

inico
La afinidad de una protena es proporcional
a la concentracin de sal requerida para
liberarla del material.
Una columna se carga (de protenas) con
un amortiguador de baja fuerza inica y la
elusin se inicia por incremento de la
concentracin del amortiguador de elusin.

Desarrollo de una cromatografa

de intercambio inico
Hidratacin y Lavado de la resina
Activacin (lavado con cido y base
fuerte diluidos, HCl 1M seguido de NaOH
1M y finalmente con la sal que se usar
ej. NaCl 1M y equilibrar con buffer sin sal)
Volumen de la columna y capacidad de
retencin de la resina.

Diferentes sales tienen diferentes fuerzas

de elucin cuando se usan en
cromatografa de intercambio inico.
Intercambio del anin
citrato>sulfato>oxalato>I->NO3-2>CrO4->Br> SCN- > Cl- > Formiato

Intercambio del catin

Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd > Cu >
Co
>
Zn>Mg>Ti+>
Ag
>
Rb+>Cs+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+

Amortiguadores
Para intercambiadores aninicos se
deben usar amortiguadores catinicos
o zwitterionicos
No usar amortiguadores aninicos pues
se unen a la resina.
Usar detergentes catinicos o no
inicos.

Cromatograma de intercambio
inico
b

A 280 nm

500

30

60

90

Tiempo de retencin (min)

NaCl mM

53

Hidroxiapatita (HA)
Introducida por Tiselius et al. en 1956
Bernardi realiz un estudio sistemtico
(Meth. In Enzimol. Vol. 22 y 27)

TiseliusAetal.,(1956)Proteinchromatographyoncalciumphosphate
columns,ArchBiochemBiophys65,132155

Frmula
Forma cristalizada de fosfato de calcio
(Ca10(PO4)6(OH)2)

KawasakiTetal.,(1985)Hydroxyapatitehighperformanceliquidchromatography:

columnperformanceforproteins,EurJBiochem152,361371

Unin selectiva de protenas a

la hidroxiapatita
A, es una protena
bsica.
B, es una protena
acdica
El
tringulo
indica
enlaces de coordinacin.
Los dobles parntesis
indican repulsin.
Las lneas punteadas
indican enlaces inicos.

Losgruposaminosonatradosporlossitiosfosfatopero
repelidosporlossitioscarboxilo.Estoesalcontrariopara
loscarboxilos.

Adsorcin de grupos amino

Se debe a interaccin electrosttica no
especfica entre su cargas positivas y
las cargas generales negativas de la
columna de HA cuando la columna es
equilibrada con amortiguador de
fosfato.

Incremento de la unin de aminas

por bloqueo de la repulsin.
A, es una protena
bsica.
B, es una protena
acdica
El
tringulo
indica
enlaces de coordinacin.
Los dobles parntesis
indican repulsin.
Las lneas punteadas
indican enlaces inicos.

Losgruposfosfatosensolucinpuedencubriracalciosque
repeleranalosgruposaminos.

Disociacin selectiva de la
hidroxiapatita
A, es una
bsica.
B, es una
acdica
El tringulo
enlaces
coordinacin.
que estos
afectan.

protena
protena
indica
de
Notar
no se

Efecto de la concentracin de
fosfato en la unin de protenas
El perfil superior fue
cargado con fosfato 1
mM
El inferior, con fosfato
50 mM.
La capacidad de unin
de las IgG se mejor
reduciendo
la
competencia
de
contaminantes.

Barrido con dos gradientes

El primer gradiente va de
0 a 500 mM de cloruro de
sodio.
El segundo, de 0 a 500
mM de fosfato de potasio.
El amortiguador base es
0.5 M MES, 1mM fosfato,
pH 6.
La elusin de la IgG se
observa en gris

Usos
Purificacin de:
Protenas
cidos nuclicos
Virus

Bases de la Tcnica
Su selectividad no depende de la masa
molecular, densidad de carga o punto
isoelctrico.

Bases de la tcnica
La adsorcin y la elucin de las protenas
no son procesos en reversa de un solo
efecto.
Los grupos amino y carboxilo actan de
manera diferente en la adsorcin de las
protenas a la HA.
La elucin de protenas cidas y bsicas
por diferentes sales tiene deferentes
mecanismos.

Ventajas
HA tiene poco poder de adsorcin de
molculas de masa molecular baja
como nucletidos, sales y aminocidos.
Es relativamente incompresible.
Existen variantes cermicas ms fciles
de trabajar pues no se compactan.

Cromatografa hidrofbica

Cromatografa Hidrofbica
Los grupos adicionados al soporte son el
alcohol octlico, grupos bencnicos u otros
grupos hidrfobos como hidrocarburos
(C4, C8 o C18).
Los centros hidrfobos de las protenas son
expuestos por exceso de salinidad y son
atrapados por la columna.

53

A
280 nm

500

30

60

90

Tiempo de retencin (min)

(NH4)2SO4 mM

Cromatograma hidrofbico

Series caotrpicas
Aniones
PO4>SO4>CH3COO>CL>Br>NO3
>ClO4>I>SCN
Cationes
NH4+>Rb+>K>Na+>Cs+>Li+>Mg>Ca2+>B
a2+

Cromatografa de Afinidad

Sistema muy poderoso de purificacin

Sistema restringido
Se basa en la interaccin especfica de
dos compuestos
Antgeno - Anticuerpo
Enzima - sustrato
Receptor - Ligando

HPLC
Cromatografa lquida de alta
resolucin
High-performance liquid
chromatography

Limitaciones de la cromatografa
a bajas presiones
Imposibilidad fsica de aumentar el flujo
Resinas compresibles

Corridas de muchas horas

Grandes volmenes

Descubrimientos que
facilitaron la HPLC
Sntesis de resinas incompresibles
Nuevas tcnicas en el empaque de
las columnas
Microparticulacin de las resinas
Adelantos
en
la
tecnologa
espectrofotometrica

Tipos de HPLC

De exclusin molecular
Intercambio inico
Hidrofbica
Afinidad
De fase reversa

Instrumentacin
Sistema de bombeo

Resistente a qumicos
Poca variabilidad
Presiones de 30 as 400 atm
Flujo constante (libre de pulsos)
Buen mezclado de los solventes
Reproducibilidad en la formacin
gradientes

de

los

Tipos de bombas

Jeringa
Pistn recproco
Diafragma
Presin constante

Detectores
Detectores de UV-Visible que pueda
leer 2 o ms longitudes de onda al
mismo tiempo
Detector de arreglo de diodos. Espectro
de 200 a 600 nm en menos de 1
segundo.

Cromatografa de fase reversa

Se basa en las propiedades hidrofbicas de las
protenas.
El proceso de elucin es diferente que en la
cromatografa hidrofbica
La fase mvil es un solvente orgnico (metanol,
2-propanol o acetonitrilo) acidificado (TFA,
cido fosfrico, actico o hidroxibutrico).

Fase estacionaria
Slica acoplada con un derivado alquilsilano.
La longitud de la cadena alquilo puede ser de
C4, C8, C18.
La porosidad del soporte es variable y se
recomienda que sea entre 300 a 1000 A
El tamao de las partculas es de 5 a 20 m
o

Fase mvil
La acidez de la fase mvil:
Influencia el estado inico de la
protena
Controla la ionizacin de la superficie
silanol
Forma pares inicos con la zona
catinica de la protena
Favorece la exposicin de zonas
hidrofbicas de la protena

Cromatograma de fase reversa

17

20

Tiempo de Retencin (min)

40

AcN (%)

40

215

80

HPLC de Fase Reversa

Separacin
eficiente
an
con
concentraciones altas de protenas
Bajo ruido de fondo
Solventes voltiles
Fcil formulacin de la fase mvil
Reproducibilidad de gradientes.

Diagrama del sistema HPLC

Termostato de la columna

Celda Microbore
Columna

Celda Analtica
Celda Preparativa

Manejador de muestras

Manejador de solvente

HPLC WATERS
modelo antiguo

HPLC WATERS

Cromatgrafo de Gases

Principales componentes
Gas de acarreo
Controladores de flujo
Inyectores
Columnas
Detectores
Sistema de datos

Gas de acarreo
Con ciertos tipos de columnas y detectores, se requiere
el uso de un gas de complemento en el detector (makeup).
El make-up, es un gas de arrastre adicionado al
efluente de la columna antes de que pase al detector.
El sistema del gas portador, por lo general contiene uno
o varios tamices con el objeto de eliminar humedad,
hidrocarburos y oxgeno.
Los caudales utilizados en las columnas empacadas
oscila entre 25 y 90 mL/min y de 1 a 2 mL/min en las
capilares.