Controle Microbiolgico

de Produtos no
estreis

Produtos no estreis so aqueles nos quais se admite

conceitualmente a presena de carga microbiana, embora
limitada, tendo em vista as caractersticas de sua utilizao.

Cosmticos, produtos farmacuticos tpicos e orais

Contato com reas portadoras de flora microbiana natural!!!

Ateno no CQ destes produtos deve assegurar que a

carga microbiana presente (quali e quantitativo) no
comprometa a sua qualidade final ou mesmo a
segurana do paciente.

 Altas cargas microbianas presentes

farmacutico no estril podem comprometer:

no

produto

A segurana do paciente e/ou usurio que no esteja

saudvel, dependendo ainda das caractersticas de utilizao
de cada produto.
A estabilidade do mesmo, interferindo diretamente na sua
qualidade intrnseca.

A qualidade microbiolgica de um produto no

estril proporcionada pela adoo e respeito s
Boas Prticas de Fabricao, sendo necessrio e
complementar s BPF a adio de conservantes.

Segundo RDC 162/01, apresentada a definio de

conservantes :
So substncias adicionadas aos Produtos de
Higiene Pessoal, Cosmticos e Perfumes com a
finalidade primria de preserv-los de danos e/ou
deterioraes causados por microorganismos durante
sua fabricao e estocagem, bem como proteger o
consumidor de contaminao inadvertida durante o
uso do produto.
permitida a associao de substncias conservantes obedecidos seus
limites individuais.
Em casos especiais, quando houver necessidade de utilizar-se uma
concentrao que ultrapasse os valores individuais estipulados na lista, a
empresa dever apresentar documentao tcnico-cientfica justificando o
seu uso.

RDC 162 de 2001, estabelece a lista de substncias de

ao conservantes para produtos de higiene pessoal,
cosmticos e perfumes.
Sistemas conservantes devem apresentar
caractersticas para suas substncias:

algumas

- Possuir amplo espectro de ao microbiana;

- No mudar as caractersticas organolpticas do produto;
- No interagir com componentes da formulao;
- Ser estvel em ampla faixa de pH;
- Devem includas nas formulaes sob concentrao
mnima de eficcia e mxima descrita em legislao.

CQ tem como objetivo imediato comprovar a ausncia de

microorganismos patognicos e determinar o nmero de
microorganismos viveis, em funo dos tipos de utilizao
do produto.
Ex. consumidor ser debilitado ou imunodeprimido;
Cosmticos em pele sensvel beb.
Cuidados quanto ao limite microbiano!!!

Risco ao consumidor:
Saprfitas agentes infectantes oportunistas (deteriorao de
produtos) TOLERA-SE CARGA MICROBIANA!!!
Patognicos (Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus) risco de
quadro clnico infeccioso PROIBITIVO A PRESENA!!!

Estabilidade do produto:
Perda da eficcia teraputica por degradao do PA:
ou por alterao de parmetro fsico fundamental para sua atividade
ex. pH,
ou alterao de propriedades fsico-qumicas entre elas: produo
de gases odor desagradvel, ao enzimtica levando a degradao
de tensoativos quebra da emulso ou alterao na viscosidade.
PREOCUPAO COM AS POSSVEIS FONTES DE CONTAMINAO:
CONTAMINAO
- DIRETAS: Fluidos gasosos, gua e demais matrias-primas
(principalmente origem natural).
- INDIRETAS: procedimentos de limpezas, instalaes inadequadas,
pessoal no paramentado, processos no validados...

Lembrar que a carga microbiana (CM) pode ser alterada

durante o processo de fabricao ou mesmo durante o tempo
de prateleira do produto, por diversos fatores:
Frmula: presena de protenas e carboidratos
(cosmticos) se a concentrao no for hiperosmtica
favorece a elevao de CM.
em contrapartida, presena de etanol, sorbitol,
sacarose, propilenoglicol tendem a favorecer CM mais baixas,
nas concentraes normalmente utilizadas em lquidos.
Conservantes: usados com critrio podem
interagir com componentes da frmula e ter sua atividade
reduzida.
pH: microorganismos crescem em pH neutro, com efeitos
inibitrios em faixas extremas (cidas ou alcalinas).

 Atividade da gua: fundamental para sobrevivncia de

microorganismos. Portanto os produtos em gua
dependem de incorporao de conservantes. Recorrer
quando possvel s frmulas extemporneas!!!

Processo: altas temperaturas reduzem CM, j

temperaturas prximas a 40C tem efeito oposto. gua de
condensao nas paredes de reatores, ou mesmo vapor
de gua na tampa de frascos durante o resfriamento
podem ocasionar a proliferao de microorganismos

PADRES PRIMRIOS
Apesar do reconhecimento, h muitos anos, da importncia
do controle microbiano de produtos no estreis, a
implantao dos padres sanitrios tem ocorrido
lentamente. Este fato pode ser observado nas
farmacopias em que os padres esto sendo includos
gradativamente.
As monografias farmacopeicas nas quais consta
especificaes para qualidade microbiolgica, de forma
geral, referem-se ausncia de uma ou mais espcies
especficas. Apesar de a carga microbiana total tambm ser
parmetro de avaliao da qualidade sanitria do produto,
o limite para o nmero de microorganismos viveis
exigncia apenas em algumas especificaes.

 A Portaria n 600, de 28 de novembro de 1997, da

Secretaria da Vigilncia Sanitria, divide os cosmticos
em dois grupos, tipo I e II, dependendo do local de
aplicao.
O tipo I refere-se a produtos para uso infantil, para
rea dos olhos e para aqueles que entra em contato
com a mucosa. O tipo II, para demais produtos
suceptveis contaminao.

- Tipo I: menos que 102/g de microrganismos totais

aerbicos. Ausncia de Pseudomonas aeruginoas,
Staphylococcus aureus, coliformes totais e fecais em 1g;
no caso do talco, ausncia de Clostrdeos sulfito
redutores, tambm em 1g.
- Tipo II difere em relao ao primeiro apenas no limite de
aerbios totais que de, menos que 103/g.

Mtodos de anlises:
- Amostragem (coleta, transporte e preparao da amostra).
- Determinao numrica ou contagem de formas viveis.
- Isolamento e identificao dos
indesejveis para serem pesquisados.

microorganismos

Medicamentos no estreis e cosmticos!!!

Amostragem
A amostragem a ser efetuada para investigao quanto aos
atendimentos
aos
padres
microbianos
deve
ser
representativa.
-Barricas ou sacos de matria-prima (p) no estril: coletar
amostras na regio inferior, mediana e superior na quantidade
de n + 1. Efetuar assepsia na rea prxima coleta de
amostras, vedar em recipiente hermtico a amostra.
- Em processos contnuos, a segmentao do processo deve
estar contemplada na amostragem.
- Produto acabado duplicata de amostra representando
incio, meio e fim do processo de enchimento e que aps
fechado a embalagem no existir a introduo de
contaminantes.

Coleta e Transporte das amostras

- Fazer as amostragens em local limpo;
- Operador treinado;
- Recipientes, dispositivos
pipetas) estreis;

auxiliares

- Temperatura adequada para trasnporte.

(esptulas,

Quantidade a ser analisada

- Quantidade depende das anlises e re-teste.
Recomendao das principais farmacopias:
- Para enriquecimento na pesquisa de patognicos: 10 g(mL)
do produto em 90 mL da soluo tampo pH 7 com inativante
do conservante ou em soluo salina com inativante do
conservante.
Obs. No caso de amostra total ser 10 g (mL) ou inferior, este
total deve ser analisado.
- A tomada de ensaio pode ser reduzida para 1 g(mL) em
amostras com alto valor agregado.

Preparao da amostra
- Verificar a presena de conservantes na frmula.
- Os conservantes devem ser inativados substncias
adequadas de acordo com natureza qumica.
Ex. Sais de amnio quaternrio
3% de polissorbato +
0,3% de lecitina.
-Ajuste do pH do produto diludo para a faixa de
neutralidade.
- Homogeneizao.
- Tratamento da amostra para permitir contato ntimo da
amostra com o meio diluente.
- Produtos oleosos adio de agente tensoativo.

Durante o preparo de amostras de produtos no estreis

para a contagem de microrganismos viveis no
patognicos, necessrio o contato dessas amostras
com diluentes biocompatveis com as clulas
microbianas.
Alguns possveis diluentes:
- soluo de NaCl 0,9% estril.
- soluo de NaCl 0,9% e peptonada a 0,1% estril.
- soluo tampo pH 7,0 estril.
- caldo lactosado estril.

Exemplo de preparo de amostra para anlise microbiolgico de

um cosmtico em diluio decimal seriada:
A diluio 1:10 de uma amostra de cosmtico pode ser obtida
homogeneizando:
1 g de cosmtico + 9 mL de diluente, ou
10 g de cosmtico + 90 mL de diluente, ou
20 g de cosmtico + 180 mL de diluente, ou
25 g de cosmtico + 225 mL de diluente, e assim por diante.
Em todos os exemplos acima, a amostra resultante diluda a
1:10 (10-1), e consequentemente, em cada mL da diluio
teremos uma quantidade de amostra correspondente a um
dcimo de mL (0,1 mL) e 0,9 mL de diluente.

Mtodos de Contagem de Microrganismos

Semeadura da amostra em profundidade (Pour Plate)
- Anlise quantitativa.
- Alquota de 1 a 2 mL da diluio da amostra para rplicas
(triplicata) de placas de Petri estreis.
- Meio de cultura no seletivo lquido, estril, fundido e
resfriado a temperatura (45-48C), cerca de 20 mL vertido
sobre a placa contendo a amostra e homogeneizao com
movimento em 8 ou S.
- Incubao na posio invertida aps solidificao.

Semeadura da amostra em profundidade (Pour Plate)

Semeadura da amostra em superfcie

- Anlise quantitativa.
- Meio de cultura no seletivo ou seletivo slido, lquido ou
semi-slido preparado e distribudo previamente em placas
de Petri ou tubos.
- As diluies so distribudas por pipetas estreis, com
volumes de 0,1 a 0,5 mL na superfcie do gel j solidificado,
e espalha com movimentos cuidadosos com basto de vidro
em L ou ala de Drigalski.
-Incubar as placas invertidas.
- Esta metodologia no se aplica a amostras com carga
microbiana inferior a 2 UFC/g (mL).

Semeadura da amostra em superfcie

Meio lquido

Meio slido inclinado

Meio semi-slido
Meio slido placa de Petri

Membrana Filtrante
- Anlise quantitativa.
- Alquotas do produto ou suas diluies filtradas em
membranas apropriadas.
- Membranas de 0,45m ou 0,20 m de poro e 47 mm de
dimetro.
- Coloca-se a membrana sobre placa contendo meio de
cultura solidificado.
- Permite amostragem de volumes elevados.

Membrana Filtrante
Sterifil aseptic
Suporte de
filtrao a vcuo
Sterifil em
polissulfona,
composto de funil,
base e copo
coletor.

Stericup
Unidade
filtrante
STERICUP com membrana
express 0,22mm e PVDF
0,45 um, funil e frasco
coletor.

Trasnferir a
membrana para
placa de Petri e
incubar

INCUBAO DAS AMOSTRAS

- Colocar placas em estufa a 30-35 C por 2 a 5 dias na
posio invertida, ou estante com tubos, para
verificar a presena de bactrias.
- Colocar placas em estufa a 20-25 C por 5 a 7 dias na
posio invertida, ou estante com tubos, para
verificar a presena de fungos e leveduras.
- Contagem: vista desarmada ou com auxlio de contadores.
Transcorrido o tempo de incubao, considerar a contagem,
somente das placas da mesma diluio que apresentarem de
30-300 colnias. Multiplica-se a mdia das mesmas pelo
respectivo fator de diluio e se expressa o resultado em
UFC/g de amostra.

Nmero Mais Provvel (NMP)

- Anlise estimativa fundamentada em probabilidade.
- Indica o valor dentro de uma faixa que reflete o nmero de
organismos presentes.
- Embora apresentando impreciso maior oficilamente
recomendado.
- Melhor revitalizao de microrganismos estressados perfeito
contato com o meio de cultura.
-Recomendado para amostras pouco solveis e translcidas.
- Permite amostras com nveis elevados de concentrao, mas
indicado para quando se espera valores baixos de contagemcaldo de dupla concentrao

Nmero Mais Provvel (NMP)

- Emprega meios lquidos diluies seriadas das amostras
inoculadas nos mesmos.
- Uso de tabelas estatsticas.
- Nmero de rplicas de cada diluio pode variar - o mais
comum : 3 ou 5 rplicas.
-As tabelas oferecem o nmero mais provvel de
microrganismos por mL ou g e os limites inferior e superior
(limite de confiana de 95%)
- Leitura e obteno dos resultados se d por comparao com
padro de turvao de meios de cultura no seletivos.

Para a escolha da tabela na qual se verificar o NMP

correspondente combinao de tubos positivos, atentar
para a quantidade (g ou mL) de amostra que foi realmente
inoculada em cada tubo das diferentes sries e no o volume
inoculado.

Inoculao de
1,0 mL da diluio 10-1 na 1 srie
1,0 mL da diluio 10-2 na 2 srie
1,0 mL da diluio 10-3 na 3 srie

Quantidade de amostra
inoculada em cada srie
0,1 g ou mL
0,01 g ou mL
0,001 g ou mL

Quando inoculamos mais de 3 diluies seriadas, selecionar a

maior diluio na qual todos os tubos inoculados so
positivos e considerar as 2 diluies seguintes maiores que a
selecionada.

Exemplo 1: Amostra de medicamento lquido que foi

inoculada nas diluies abaixo e apresentaram os seguintes
resultados:

10-2
10-3
10-4

3 tubos positivos
2 tubos positivos
0 tubos positivos

O valor de NMP a ser lido na tabela correspondente seria 3/2/0,

que corresponde ao valor 93 NMP/g ou mL. Como, neste caso a
amostra estava diluda a 10-2, o resultado obtido na tabela
deve ser multiplicado por 100 para a obteno do valor do NMP
real por grama ou mL do alimento em anlise. Assim, o
resultado final ser: 9300 NMP/g ou mL.

EXERCCIO.
Uma amostra de fitoterpico (cavalinha em p) foi
submetido contagem
microbiana pela tcnica de
semeadura em superfcie, onde uma alquota de 10 g foi
pesada e homogeneizada com 90 ml qsp de diluente
biocompatvel contendo polissorbato. A seguir, foram feitas
diluies seriadas na razo de 1:10 at a diluio 10-3
(alquotas de 1mL em 9mL de diluente). A seguir, cada
diluio foi plaqueada em meio de cultura TSA fundido (em
triplicata), seguindo-se a incubao das placas inoculadas.
Baseado no exposto acima, pergunta-se: Qual foi a
quantidade de amostra dispensada na triplicata de placas
correspondente diluio 10-2 ?