Universidad del Valle de Mxico

Escuela de Ciencias de la Salud

Qumico Farmaco Biotecnlogo
Desarrollo Analtico

Validacin
de Mtodos Analticos

I.Q. Manuel Arturo Caballero Rdz.

Campus Monterrey Norte

Validacin de mtodos
analticos
En este tema se pretenden responder las siguientes
interrogantes:

Qu es validar?
Por qu valido?
Para qu valido?
Cundo valido?
Cmo valido?

Validacin de mtodos
analticos
?

Por qu es necesaria la validacin analtica?

Generar confianza

Validacin de mtodos
analticos
Cul es el propsito de la validacin
analtica?
Mtodos reproducibles y confiables

Validacin de mtodos
analticos
Validacin: Confirmacin mediante examen y aporte de
evidencia objetiva de que se han cumplido los
requisitos para una utilizacin o aplicacin especfica
prevista de un mtodo analtico.

Validacin de mtodos
analticos
En otras palabras Es realizar un conjunto de pruebas
de manera que podamos:
a) Comprobar varios aspectos del comportamiento del
mtodo.
b) Establecer que sirve para el fin previsto.

Validacin de mtodos
analticos
La validacin implica la determinacin de
las fuentes de variabilidad y del error
sistemtico de un procedimiento, no slo
dentro de la calibracin sino en el anlisis
de muestras reales.

Verificacin de mtodos
analticos
Verificacin: Aportacin de evidencia objetiva de que un
mtodo satisface los requisitos especificados.
En la verificacin de mtodos se suele indicar el proceso
que lleva a cabo el laboratorio con el fin de demostrar su
capacidad para ejecutar correctamente un mtodo
normalizado cuando lo realiza exactamente como est
descrito en la norma.

Para qu valido un mtodo

analtico?
Para cumplir con requisitos de las
normas internacionales:
BPM (industria farmacutica).
Norma ISO 71025 (acreditacin de
laboratorios de ensayo y calibracin).
Norma ISO 15189 (acreditacin de
laboratorios clnicos)
Organismos internacionales como
FAO, USP y otras farmacopeas,
OMS, ICH.

Para qu valido un mtodo

analtico?
Para emitir resultados exactos y precisos, que sean
reproducibles, y con esto generar la confianza de nuestros
clientes.

Cules son los tipos de mtodos?

Mtodos Normalizados
Mtodo analtico desarrollado por
un organismo de normalizacin u
otro organismo reconocido cuyos
mtodos son generalmente
aceptados por el sector tcnico
correspondiente. (Ref. ILAC-G18)

Cules son los tipos de

mtodos?
Mtodos No Normalizados

Mtodo analtico desarrollado

por un tercero o que ha sido
adaptado por el laboratorio a
partir de un mtodo
normalizado. (Ref. ILAC-G18)

Cules son los tipos de mtodos?

Mtodos desarrollados por el
Laboratorio
Mtodo analtico que no se
encuentra en normas u otras
colecciones de mtodos, ni en
publicaciones de terceros,
habiendo sido desarrollado por el
propio laboratorio.

Qu mtodos se validan?
1. Los Mtodos No Normalizados.
2. Los Mtodos desarrollados por el Laboratorio.
3. Los Mtodos Normalizados utilizados fuera del
alcance previsto.
4. Los Mtodos Normalizados que han sido
modificados por el Laboratorio.

Qu mtodos se verifican?
1. Los Mtodos Normalizados.
2. Los Mtodos Oficiales.
3. Los Mtodos de Org. Nacionales o Internacionales
reconocidos.

Valido un mtodo cuando

Se incorporan mejoras al mtodo.
Se ampla su alcance para matrices complejas.

Verifico un mtodo cuando

Las pruebas de evaluacin de desempeo indican
rendimiento deficiente.
Se reemplacen equipos importantes que puedan
afectar la calidad de los resultados.

Verifico un mtodo cuando

Nota: Cuando se cambia el
analista no necesariamente se
debe verificar el mtodo de
nuevo, sino que se hace una
evaluacin de desempeo del
analista, antes de autorizarle su
ejecucin rutinaria.

Clasificacin de mtodos
De acuerdo a varios organismos internacionales, entre
ellos la USP, los mtodos entran en las siguientes
categoras:

Categora I
Categora II
Categora III
Categora IV
Mtodos Microbiolgicos

En todos ellos puede ser aplicable la validacin.

Clasificacin de mtodos
Categora I
Pruebas cuantitativas del contenido del principio activo,
son procedimientos qumicos o microbiolgicos que
miden el analito presente en una muestra determinada.

Clasificacin de mtodos
Categora II
Pruebas para la determinacin del contenido de
impurezas o de valores lmite para el control de
impurezas.
Pueden ser pruebas cuantitativas o una prueba
cualitativa para determinar si la impureza est presente
en la muestra por encima o por debajo de un valor
lmite especificado.

Clasificacin de mtodos
Las Categoras I y II miden con exactitud las
caractersticas de pureza de una muestra.
Los parmetros de validacin requeridos por una
prueba cuantitativa son diferentes a los de una prueba
cualitativa de cumplimiento de lmite.

Clasificacin de mtodos
Categora III
Pruebas fisicoqumicas que miden caractersticas
propias del desempeo del producto, por ejemplo la
prueba de disolucin en medicamentos.
Las caractersticas de validacin son diferentes a las de
otras pruebas, aunque las pueden incluir.

Clasificacin de mtodos
Categora IV
Pruebas de identificacin. Aquellas que se realizan para
asegurar la identidad de un analito en una muestra. Esto
normalmente se realiza por comparacin de una
propiedad de la muestra, contra la de un estndar de
referencia, por ejemplo espectros, comportamiento
cromatogrfico, reactividad qumica y pruebas
microcristalinas.

Clasificacin de mtodos
Pruebas Microbiolgicas
Aquellas que se realizan para asegurar la calidad
microbiana del medicamento.

Consideraciones al validar mtodos

La validacin debe reflejar las condiciones reales del
ensayo.
La debe realizar personal calificado para esa
actividad.
La extensin de la validacin necesaria depender
del mtodo y de su aplicacin.
Para validar un mtodo de ensayo, siempre se debe
partir de la descripcin del mtodo de ensayo.

Cmo implementar un
mtodo analtico nuevo?

Cmo implementar un
mtodo analtico nuevo?
1. De preferencia, que sea un mtodo normalizado de
versin reciente.
2. Que el mtodo sea apropiado para el tipo de muestra a
analizar.
3. Determinar si el Laboratorio cuenta con personal
capacitado para el anlisis a realizar.
4. Determinar si el Laboratorio cuenta con las
instalaciones y condiciones ambientales requeridas
para el anlisis.

Cmo implementar un
mtodo analtico nuevo?
5. Descripcin del procedimiento incluyendo el alcance del
mtodo (aplicabilidad, tipo), tipo de compuestos y de
matriz.
6. Detalle de reactivos, estndares de referencia que se
utilizan.
7. Lista de equipos y requisitos de funcionamiento y
rendimiento.
8. Detalle de las condiciones e implementacin del
mtodo, incluyendo la preparacin de la muestra.

Cmo implementar un
mtodo analtico nuevo?
9. Definir los procedimientos estadsticos y clculos
representativos.
10. Definir los procedimientos para el control de calidad
de la rutina.
11. Definir los grficos representativos, cromatogramas,
espectros y curvas de calibracin.
12. Definir los criterios de aceptacin/rechazo de datos.
13. Consideraciones de seguridad.

Etapas para desarrollar un

mtodo analtico

Bosquejo de requisitos para

validar

Parmetros del desempeo del

mtodo analtico
Son las propiedades, caractersticas o capacidades
cuantificables del mtodo que indican su grado de
calidad. stos son:
Exactitud
Repetibilidad
Precisin intermedia
Reproducibilidad
Especificidad
Lmite de deteccin
Lmite de cuantificacin
Linealidad
Rango
Sensibilidad
Robustez

Parmetros del desempeo del

mtodo analtico segn ICH

Parmetros del desempeo del

mtodo analtico segn la USP
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Extensin de la validacin
Mtodos nuevos requieren validacin completa.
Mtodos de Farmacopea o referencias oficiales
requieren validacin parcial (o verificacin).
Cambios significativos implican revalidacin parcial.
Cambios de equipo
Cambios de frmula
Cambios de proveedores de reactivos crticos.

Estimacin de la Exactitud
Varias maneras de determinar la exactitud.

Adicin de una cantidad

conocida de estndar

Prueba de un estndar de
referencia

Comparacin con un mtodo

reconocido como exacto

Estimacin de la Exactitud
1. Agregando cantidad conocida de estndar al producto

Determinar por duplicado el contenido promedio del

analito en la muestra con el mtodo a validar.
Enriquecer las muestras con estndar: para preparar
las soluciones, se mantiene constante la cantidad de
muestra tomada y se agregan cantidades variables del
estndar.

Estimacin de la Exactitud
1. Agregando cantidad conocida de estndar al producto

La exactitud es evaluada utilizando un mnimo de 9

determinaciones, 3 concentraciones con 3
determinaciones para cada una. Ejemplo: concentraciones
de 80%, 100% y 120% de la concentracin normal.
Calcular el % de Recuperacin con la frmula
% Rec = (valor medido) / (valor verdadero) 100

Estimacin de la Exactitud
1. Agregando cantidad conocida de estndar al producto

Criterio de Aceptacin y Documentacin

El % Rec debe estar entre 90 y 110% del valor real.
Para trazas:
Menor a 100 ppb: 60 a 110% de Rec
Mayor a 100 ppb: 80 a 110% de Rec
Menos de 1 ppb: 70 a 120% de Rec

Estimacin de la Exactitud
2. Comparando los resultados con un estndar o Material de
Referencia Certificado.

Determinar por duplicado el valor promedio del

estndar o material de referencia certificado por el
mtodo a validar. Comparar el resultado obtenido con el
valor declarado.
Tomar en cuenta la disponibilidad y estabilidad del
estndar o MRC.

Estimacin de la Exactitud
2. Comparando los resultados con un estndar o Material de
Referencia Certificado.

La exactitud es evaluada utilizando un mnimo de 30

determinaciones: 5 concentraciones y 6
determinaciones para cada concentracin.
Criterio de Aceptacin y Documentacin: El % de Rec
debe estar entre 98 y 102% del valor terico.

Estimacin de la Exactitud
3. Comparando los resultados con un mtodo oficial con exactitud
bien definida.

La muestra debe ser analizada utilizando el mtodo a

validar y un segundo mtodo bien caracterizado, de
exactitud bien definida y establecida.
Se analizan 6 muestras por duplicado a la concentracin
normal de trabajo por ambos mtodos.
Se hace un anlisis de varianza y de %Rec para
determinar si hay o no diferencia significativa entre los dos
mtodos comparados.

Precisin de los resultados

analticos
Hay 3 niveles para determinar la Precisin del Mtodo:

Repetibilidad
Reproducibilidad
Precisin intermedia

Precisin de los resultados

analticos
Repetibilidad: Coincidencia entre los resultados de
mediciones sucesivas realizadas en las mismas
condiciones de medicin.
Reproducibilidad: Coincidencia entre los resultados de
mediciones realizadas en diferentes condiciones de
medicin hechas en laboratorios diferentes.
Precisin intermedia: Medida de la precisin de los
resultados de un mtodo en condiciones diferentes de
analista, da, equipo y lote de reactivos, dentro del
mismo laboratorio.

Precisin de los resultados

analticos
N
o

o
e
p
recis s n
ecelos
Repetibilidad: Coincidencia
entre
resultados de
s
irealizadas
riomismas
n inte enalas
mediciones sucesivas
de t e
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r
m
rmin
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rmin
condiciones de medicin.
ar
ado
c uan
repro
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ducib
h
Reproducibilidad: Coincidencia entre los resultados
de
ilidad a
mediciones realizadas en diferentes condiciones de .
medicin hechas en laboratorios diferentes.
Precisin intermedia: Medida de la precisin de los
resultados de un mtodo en condiciones diferentes de
analista, da, equipo y lote de reactivos, dentro del
mismo laboratorio.

Precisin - Repetibilidad
Trabajar con submuestras de una muestra homognea,
bajo las mismas condiciones de medicin:
El mismo procedimiento de medicin.
El mismo observador.
El mismo instrumento de medicin.
En un periodo corto de tiempo.
Hay 2 formas de determinarla

Precisin - Repetibilidad
Hay 2 formas de determinarla:
Hacer un mnimo de 9 determinaciones, 3 rplicas a 3
concentraciones diferentes.
Hacer un mnimo de 6 determinaciones a una
concentracin que corresponda con la de la muestra
problema.

Precisin Intermedia
Se determina realizando un mnimo de 6
determinaciones al 100% de la concentracin esperada
(diferentes das, analistas y equipo).
Criterio de Aceptacin y Documentacin:
RSD < 2.0% para macrocomponentes
RSD < 10.0% para componentes menores
RSD < 3.0% en mtodos empleados en disolucin
RSD < 10.0% para muestras biolgicas

Precisin - Reproducibilidad
Se determina realizando un mnimo de 6
determinaciones al 100% de la concentracin esperada
(diferentes das y horas del da, analistas y equipo).
Criterio de Aceptacin y Documentacin:
Registrar los resultados: la media, desviacin estndar,
desviacin estndar relativa, y el intervalo de confianza.
Considerar los mismos criterios que en Precisin
Intermedia, aunque se espera una variabilidad mayor.

Lmite de Deteccin
Documentacin
Imprimir el cromatograma o registrar la menor
concentracin detectable en una hoja de registro.
Criterio de Aceptacin
No hay un lmite de deteccin mnimo. Sin embargo, para
mtodos cromatogrficos el lmite superior suele ser un
valor de al menos 3 veces la lnea base (nivel de ruido).
Canadian Health Protection Branch (CHPB) establece
una razn de 3:1 entre la seal y el ruido.

Lmite de Deteccin
Para Mtodos No Instrumentales
Se preparan 10 blancos independientes y 10 blancos
enriquecidos a la concentracin ms baja aceptada. Se
hacen las mediciones y se calcula la desviacin
estndar.
Con estos datos se puede calcular el lmite de
deteccin:
LD = Valor promedio del blanco + 3s

Lmite de Cuantificacin
Este valor puede ser la menor concentracin en la
curva patrn.
Documentacin
Imprimir el cromatograma o anotar el dato de la menor
concentracin cuantificable en la hoja de datos. Proveer
datos que demuestren exactitud y precisin requeridas
en el criterio de aceptacin.

Linealidad
1. Preparar solucin madre con el analito.
2. Preparar al menos 5 diluciones con concentraciones
de analito entre el 80 al 120% de la concentracin
esperada, o bien entre 50-150%.
3. Analizar por duplicado cada dilucin.
Criterio de Aceptacin y Documentacin
Graficar curva de calibracin. Los valores deben caer
dentro de una zona horizontal angosta. Los que queden
fuera no son aceptables para ser incluidos en el
intervalo normal de trabajo.

Linealidad
r mayor o igual a 0.99 (coeficiente de correlacin)
r2 mayor o igual a 0.98 (coeficiente de determinacin)
CV menor o igual a 2.0% (coeficiente de variacin, o
RSD desviacin estndar relativa)
b aproximadamente igual a 0.
m igual a la sensibilidad del sistema (pendiente de la
curva)

Bibliografa
Validacin de Mtodos Analticos, Fisicoqumcos y
Microbiolgicos
Qum. Lucrecia Arreola
Manual de Mtodos Analticos para la Determinacin
de Parmetros Fisicoqumicos Bsicos en Aguas
Carlos Alberto Severiche Sierra
Marlon Enrique Castillo Bertel
Rosa Leonor Acevedo Barrios