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Protenas de

Inters
Farmaceutico.
Gentica Molecular

El cido desoxiribonucleico (ADN) contiene la informacin necesaria para la


sntesis de protenas. El descubrimiento del cdigo gentico abri la posibilidad de
obtener pptidos y/o protenas a gran escala a partir de diversos organismos en los
cuales no se producen de manera natural. A las protenas obtenidas de esta
manera se les conoce como PR. stas se pueden producir en microorganismos
como bacterias, hongos, virus y levaduras, as como en lneas celulares cultivables
de insectos, plantas y de mamferos (Jonasson et al., 2002; Palomares et al., 2004),
sistemas de expresin de protenas sin clulas y tambin en animales y plantas
trangnicas (Farrokhi et al., 2009).

La sobreexpresin de PR ofrece la ventaja de producir grandes cantidades de la

protena de inters con caractersticas similares a la protena natural y de manera


relativamente fcil y rpida. Esta tecnologa cuenta con al menos 35 aos y por su
aplicacin tanto en la industria farmacutica y alimentaria, como en la
investigacin cientfica, se encuentra entre los desarrollos ms importantes del
siglo XX (Porro et al., 2005).

Conceptos Generales
Proteina:
Molculas formadas por cadenas lineales deaminocidos.

Son macromolculas
compuestas por carbono, hidrgeno, oxgeno y nitrgeno. La mayora tambin contienen azufre y fsforo. Las mismas estn
formadas por la unin de varios aminocidos, unidos mediante enlaces peptdicos. El orden y disposicin de los aminocidos
en una protena depende del cdigo gentico, ADN, de la persona.

Las protenas constituyen alrededor del 50% del peso seco de los tejidos y no existe proceso biolgico alguno que no

dependa de la participacin de este tipo de sustancias.

Biofrmaco:
Son producidos por organismos genticamente modificados (genetically modified organisms GMOs). A diferencia de las

protenas de origen natural, las protenas recombinantes pueden ser producidas en grandes cantidades lo que ha permitido
cubrir la creciente demanda actual. En contraste con las protenas no humanas obtenidas de animales como por ejemplo la
insulina de cerdo, las protenas recombinantes son idnticas o difieren ligeramente respecto a las protenas nativas de origen
humano, por lo que las reacciones inmunolgicas adversas disminuyen significativamente

Vector:
Unvector gnicoes un agente que transfiere informacingentica, por algn medio, de un organismo a otro. Son utilizados

enbiotecnologaunVector de clonacin para portar elADN recombinantedesde una clula donadora hasta la clula
receptora en los que se inserta el gen que se quiere transferir. A continuacin se infecta la clula hospedadora con ese
vector recombinante, obtenindose laclula transgnica.

Un vector con el que los cientficos experimentan son losplsmidos, con los que es posible insertar genes forneos al ncleo

de una clula. Otros vectores gnicos son los bacterifagosycsmidos. Tambin se puede considerar vectores genticos a
losvirus, puesto que en el curso de su ciclo insertan informacin gentica en las clulas que invaden.

Procedimiento para producir una PR


consiste en introducir el ADN que codifica para la protena de inters en un vector de

sobreexpresin (plsmidos, virus, csmidos). El vector contiene un origen de


replicacin que le permite copiarse dentro de la clula hospedera, una regin
promotora que permite la produccin de la protena de inters, un sitio de clonacin
mltiple (SCM), que es una regin que contiene diversos sitios de restriccin que
permiten la insercin de ADN entre ellos y en algunos casos, genes de resistencia a
antibiticos y genes reporteros, que facilitan la seleccin de las colonias de bacterias
que tendran el vector con la informacin gentica insertada.

Por ejemplo, para crear un plsmido recombinante, se lleva a cabo un procedimiento

de ligacin que permite insertar dentro del SCM del vector, un segmento de ADN que
corresponde al marco de lectura funcional, que contiene la informacin para la
generacin de la protena de inters. Al producto de este vector, ms el fragmento de
ADN codificante (inserto), se denomina construccin. El siguiente paso es la
transformacin, sta se realiza al insertar la construccin dentro de la clula
hospedera y sta se convierte en una fbrica celular de la protena de inters
(Palomares et al., 2004). La bacteria Escherichia coli es uno de los sistemas de
sobreexpresin ms utilizados para la produccin de PR.

Funciones de las protenas

Las funciones principales de las protenas en el organismo son: Ser esenciales para el crecimiento.
Las grasasy carbohidratos no las pueden sustituir, por no contener nitrgeno.
Proporcionan losaminocidos esenciales fundamentales para la sntesis tisular .
Son materia prima para la formacin de los jugos digestivos, hormonas, protenas plasmticas,

hemoglobina,vitaminasy enzimas.

Funcionan como amortiguadores, ayudando a mantener la reaccin de diversos medios como el plasma.
Energticamente, las protenas aportan al organismo 4 Kcal de energa por cada gramo que se

ingiere.

Actan como catalizadores biolgicos acelerando la velocidad de las reacciones qumicas del metabolismo.

Son las enzimas.


Actan como transporte de gases como oxgeno y dixido de carbono en sangre. (hemoglobina).

Actan como defensa, los anticuerpos son protenas de defensa natural contra infecciones o agentes

extraos.
Permiten el movimiento celular a travs de la miosina y actina (protenas contrctiles musculares).

Resistencia. El colgeno es la principal protena integrante de los tejidos de sostn.


Las protenas estn mayormente presentes en alimentos de origen animal: carnes, huevos, leche y en

menor proporcin en vegetales como la soja, legumbres, cereales y frutos secos.

De la farmacutica a la
biofarmacutica
La biotecnologa ha impactado el rea de la
medicina, principalmente con su contribucin al
conocimiento a nivel molecular de la causa de
diversas enfermedades, lo cual ha generado una
revolucin en la industria farmacutica con la
produccin de biofrmacos contra enfermedades
especficas. Un biofrmaco es una molcula
biolgica con fines teraputicos obtenida a partir
de un organismo vivo, ya sea a partir de bacterias,
hongos, clulas animales, levaduras, entre otros.
Estas molculas presentan mayor accin
teraputica y menos reacciones secundarias, al
ser prcticamente homlogas a las producidas por
el organismo. Esto se traduce en que el paciente
en la actualidad puede acceder a tratamientos
ms eficaces y seguros. La gran mayora de estos
biofrmacos son protenas recombinantes. La
obtencin de protenas recombinantes se logra
mediante la insercin del gen que expresa la
protena de inters en un organismo diferente.

La expresin de estas protenas se ha convertido


en una herramienta muy popular, ya que es
posible obtener altas cantidades de protena con
bajos costos de produccin y altas purezas de
una o varias protenas de inters. que expresa la
protena de inters en un organismo diferente. La
expresin de estas protenas se ha convertido en
una herramienta muy popular, ya que es posible
obtener altas cantidades de protena con bajos
costos de produccin y altas purezas de una o
varias protenas de inters.
Un claro ejemplo de esto es el interfern
beta 1a y 1b, el cual ha elevado la calidad
de vida de los pacientes diagnosticados
con esclerosis mltiple.
La importancia de las protenas teraputicas
recombinantes se ha incrementado
exponencialmente en los ltimos 30 aos.

Esquema de Produccin de
biofrmacos
La fase inicial upstream (cuesta arriba) de produccin de biofrmacos consiste en el diseo del sistema de
expresin que implica la elaboracin mediante ingeniera gentica, del vector de clonacin del gen que codifica la
protena de inters en la clula hospedera adecuada.
La segunda fase downstream (cuesta abajo) se enfoca al proceso de purificacin, evaluacin del control de calidad y
validacin de dicho producto.
En trminos generales, la produccin de protenas recombinantes sigue el siguiente esquema:
1) tratamiento con enzimas de restriccin de un vector de clonacin y del ADN que contiene el gen que codifica la

protena de inters,
2) ligamiento del gen con el vector para obtener el ADN recombinante (ADNr),
3) internalizacin y replicacin (clonacin) del ADNr en una clula hospedera y
4) expresin del gen en la protena 2 .

Los vectores ms conocidos son plsmidos bacterianos que se caracterizan por replicarse en forma independiente al
cromosoma de la bacteria. Los vectores son molculas de ADN bicatenario que actan como vehculos de clonacin
cuya funcin es acarrear y expresar el gen en la clula hospedera. Los virus tambin son empleados como vectores
de clonacin ya que se aprovecha su capacidad de introducir y replicar su genoma en la clula 3 . El diseo del vector
basado en tcnicas de ingeniera gentica y la eleccin de la clula hospedera determinan en gran parte, las
caractersticas de la protena recombinante, las estrategias de su purificacin, rendimiento y el costo de su produccin

Sistemas de expresin*
a).Bacterias
Para la expresin de protenas no glicosiladas recombinantes suele emplearse a la E. coli como clula hospedera. A escala
industrial, el cultivo de E. coli para la produccin de protenas recombinantes suele llevarse a cabo en medios qumicamante
definidos 8 .
Los medios sintticos facilitan el aislamiento y purificacin del producto y reducen el costo de su produccin. En trminos
generales, los vectores de clonacin para E. coli contienen: el gen que codifica la protena de inters, un origen de replicacin
que determina el nmero de copias del vector, un marcador de seleccin que puede ser un gen de resistencia a antibiticos
(como ampicilina, kanamicina y tetraciclina), un promotor que regula la transcripcin del gen insertado (inserto) y un gen de
terminacin de transcripcin A nivel laboratorio, la ampicilina es el marcador frecuentemente empleado en la seleccin de
bacterias recombinantes, sin embargo, a escala industrial, la ampicilina no es el antibitico de eleccin en la produccin de
bioteraputicos para uso humano debido a su probable efecto alergnico.

Otra estrategia de obtencin de protenas recombinantes en E. coli incluye su produccin intracitoplsmica. Este
mtodo no requiere que la protena sea solubilizada ni renaturalizada para un correcto replegamiento (refolding),
. Otro sistema de expresin en E. coli incluye la produccin de protenas recombinantes insolubles en forma de cuerpos
de inclusin citoplsmica12. Este sistema tiene como ventaja un alto rendimiento del producto sin embargo se precisan
mtodos costosos para replegar el producto 8 y para eliminar las protenas y ADN de la clula hospedera12 por ello, su
aplicacin a escala industrial resulta econmicamente desventajosa. Algunos productos biofarmacuticos
recombinantes aprobados para su aplicacin y producidos en E. coli incluyen: insulina (hormona), Ecokinase
(anticoagulante), citocinas como interferon alfa 2b (IFN-2b), IFN--1a y al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-)
entre muchos otros 13 .

b). Levaduras
La produccin de protenas recombinantes comerciales se ha basado tambin, en el cultivo en medios qumicamente
definidos de levaduras como Pichia pastoris (P. pastoris) y S. cerevisiae 14. Los vehculos de clonacin empleados en
levaduras suelen acarrear como promotores al gene PGK (3-phosphoglycerate kinase, 3- fosfoglicerato quinasa), ADH1
(alcohol dehydrogenase1, alcohol deshidrogenasa 1), fosfatasa cida y genes del cluster GAL (galactosa)5,15,16..
En la industria biofarmacutica, los sistemas de expresin con levaduras son altamente valorados ya que pueden
realizarse en medios qumicamente definidos y adems no se requiere remover endotoxinas bacterianas, ambos
aspectos reducen el costo de la produccin del producto. Se han logrado obtener cepas recombinantes de S. cerevisiae
capaces de llevar a cabo la N-glicosilacin (adicin de carbohidratos al grupo R del aminocido asparagina de la
protena) de protenas heterlogas15. A pesar de la habilidad de las levaduras de glicosilar protenas, la composicin de
los azcares de estas glicoprotenas difiere de la protena nativa de origen animal
Las glicoprotenas provenientes de levaduras pueden tener una vida media baja debido a que al unirse a receptores de
manosa expresados en la superficie de macrfagos, son captadas y eliminadas por estas clulas fagocticas14. Lo
anterior ha limitado la aplicacin de levaduras en sistemas de expresin de protenas heterlogas humanas que no
requieren ser glicosiladas. Esta limitante, ha motivado la bsqueda de sistemas alternativos de expresin en levaduras
diferentes a S. cerevisiae que han probado ser ms eficientes para la produccin de glicoprotenas de naturaleza
humana como es el caso de la cepa recombinante Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) coagulacin VIIa y VIII 7

Un acercamiento a un proceso de
produccin de protenas teraputicas
recombinantes*

Imagen http://www.medigraphic.com/pdfs/residente/rr-2009/rr093c.pdf

Perspectivas
La demanda de protenas recombinantes teraputicas de consumo
humano se ha convertido en una realidad comercial y ha aumentado
dramticamente durante los ltimos aos, salvando un nmero
incontable de vidas gracias a la casi accesibilidad ilimitada de estas
protenas. Ms de 80 protenas recombinantes estn aprobadas para
consumo humano y al menos en 2008 se aprobaron 13 ms de ellas.
Adems, existen ms de 360 nuevas medicinas en desarrollo
(www.phrma.org). Aunque mucho se ha avanzado, la produccin de
protenas recombinantes constituye un campo que necesita ser mucho
ms estudiado, ms an cuando los precios de muchos de estos
medicamentos son altos y de difcil acceso en pases en vas de
desarrollo. Una de las estrategias que se deber seguir debe estar
encaminada a desarrollar nuevos procesos ms eficientes y menos
costosos de produccin de protenas teraputicas idnticas a las
aprobadas y que normalmente se conocen como biofrmacos de
segunda entrada (o biogenricos).

BASES DE DATOS DE
SECUENCIAS GENTICAS
En los ltimos aos los avances en la secuenciacin de genes han culminado en la elucidacin de la secuencia

completa del genoma humano, as como de otros organismos. Esta informacin se ha depositado en bases de datos
electrnicas disponibles para la comunidad cientfica, organizadas en libreras que contienen los genomas
completos, por ejemplo, la Librera Mayor de Genomas Microbianos (EMGLib, por sus siglas en ingls,
http://pbil.univ-lyon1.fr/ emglib/emglib.html) contiene todos los genomas de bacterias secuenciados a la fecha
(Perrire et al., 1999).

Existe un gran nmero de pginas electrnicas con bases de datos de genes, difieren bsicamente en la

informacin proporcionada, ya sea por el tipo de organismo de estudio o por la aplicacin y estudios en los que se
han enfocado. Una de las bases de datos ms utilizada por la comunidad cientfica es la del Centro Nacional para la
Informacin en Biotecnologa (NCBI, por sus siglas en ingls, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Esta base de datos
almacena la informacin referente a secuencias genmicas en el Banco de Genes (GenBank). Adems, contiene un
ndice de artculos cientficos y una recopilacin de enfermedades genticas humanas (Perrire et al., 1999).

Otras bases de datos disponibles y de libre acceso son: El banco de datos de protenas (PDB, por sus siglas en

ingls; http://www.pdb.org/pdb/home/home.do), la iniciativa de Estructura de Protenas del Instituto Nacional de


Salud de Estados Unidos (NHI por sus siglas en ingls, http://www. nigms.nih.gov/Initiatives/PSI/) y la base de datos
SPINE del Instituto Europeo de Bioinformtica (EBI, por sus siglas en ingls,
http://www.ebi.ac.uk/euprojects/index.html). Estas bases de datos proporcionan la informacin de los genes que
codifican para la protena de inters.

En algunos casos la informacin de la regin codificante est completa, pero en otros, se pueden encontrar

etiquetas de fragmentos expresados (conocidas como EST, por sus siglas en ingls). Estas regiones son de gran
utilidad para completar la regin codificante de la protena que se desea estudiar y a partir de all iniciar con el
proceso de produccin de PR. Esta propiedad es muy importante, ya que se puede investigar una protena
determinada de un organismo sin que sea necesario conocer su genoma completo, por ejemplo, se puede hacer
una bsqueda de secuencias similares conocidas de otros organismos en estas bases de datos y es posible
encontrar el gen completo, o bien slo fragmentos, que mediante el uso de primers degenerados (que son
formados a partir de secuencias conservadas en todos los organismos) se pueden obtener los fragmentos restantes
del gen mediante la tcnica del PCR.

SNTESIS DE PROTENAS
RECOMBINANTES
La ARN polimerasa (ARNpol) es una enzima que realiza una de las funciones ms

importantes de la clula: la transcripcin del ADN. Este es el proceso por el cual se


genera una copia de ARN mensajero (ARNm) a partir de un molde de ADN. En
eucariontes y procariontes este proceso se lleva a cabo por un sistema complejo
de protenas que conforman la ARNpol, sin embargo, en organismos como los
bacterifagos (p.ej. fago T7), la ARNpol es menos compleja: se compone por una
sola subunidad y es capaz de realizar todo el proceso de transcripcin, como su
homloga en organismos superiores.

BIOLGICAS
PARA LA
PRODUCCION
DE
PROTENAS
RECOMBINA
NTES

Se han desarrollado una gran variedad de sistemas de

expresin, tanto procariontes como eucariontes para la


produccin de PR. Los organismos ms utilizados son:
bacterias, levaduras, insectos, plantas y clulas de mamferos
(Basile y Peticca, 2009). En algunos de ellos se utiliza el
microorganismo completo (p.ej. E. coli) y en otros se utilizan
clulas derivadas del organismo (p.ej. cultivos vegetales,
clulas de insecto o de mamfero) o bien, se puede
implementar la expresin de protenas libre de clulas.
Los sistemas ms utilizados para la produccin de protenas

recombinantes en EUA y Europa son los microorganismos, con


un 55 % (del cual 39 % corresponde a E. coli y un 15 % a
levaduras ) y clulas de mamfero, especficamente clulas de
ovario de hmster (CHO), con un 35 % (Rader, 2008).
La bacteria E. coli, es uno de los sistemas ms utilizados para

la produccin de PR. Esta bacteria tiene la capacidad de crecer


rpidamente y con alta densidad en medios de cultivo de bajo
costo. Adems, en el mercado hay una gran disponibilidad de
cepas mutantes, un ejemplo es el sistema BL21 de
Invitrogen que carece de las proteasas lon y ompT, esto
repolimerasa T7 y que permite disminuir la sobreexpresin
basal, haciendo ms estable la expresin de la PR.

son protenas para usos industriales, como renina, amilasas, proteasas

Algunos
ejemplos de
PR producidas
en esta
bacteria E.coli

y celulasas, protenas teraputicas, como insulina, hormonas de


crecimiento e interferones, entre muchas otras (Lesley y Wilson, 2005).
Otras bacterias que tambin han sido utilizadas como modelo para la
produccin de PR son: Lactococcus lactis y Bacillus subtilis, pero en
menor grado (Morello et al., 2008; Nijland y Kuipers, 2008).

Otro de los organismos utilizados para producir PR son las levaduras.

Las ms usadas son Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae, en las


cuales se han expresado cientos de protenas diferentes (Cregg et al.,
2000; Mattanovich et al., 2004; Porro et al., 2005). Generalmente las
levaduras, al igual que las lneas celulares de insectos y mamferos se
utilizan para sobreexpresar protenas que son txicas o que no se
pueden plegar correctamente en E. coli (Kost et al., 2005; Oker-Blom y
Vuento, 2003). Adems, estos sistemas pueden realizar modificaciones
post-traduccionales, excretar la PR al medio de cultivo y tambin se
obtienen rendimientos mayores al 50 % (Grslund et al., 2008)
La expresin transitoria del gen (por sus siglas en ingls: TGE) en

clulas de mamfero es una importante tecnologa para la generacin


de PR. La TGE, cumple todos los requisitos en materia de cantidad y
calidad de los productos. Para las lneas celulares CHO y HEK293 se han
optimizado protocolos que permiten la produccin de protenas con un
alto rendimiento (Geisse y Fux, 2009). Por otro lado, en el 2009, Basile
y Peticca utilizaron al parsito Leishmania tarentolae como modelo para
la expresin de genes heterlogos.

Bibliografa
http://www.zonadiet.com/nutricion/proteina.htm
Gamboa RA, Trujillo RMA, 2009. Consultado en: http://

www.medigraphic.com/pdfs/residente/rr-2009/rr093c.pdf

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Guevara-Hernndez E, Lpez-Zavala AA, Jimnez-Gutirrez LR y Sotelo-

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