CHROMATOGRAPHIE
-Aspects gnraux-
I INTRODUCTION
La chromatographie sous toutes ses formes, est une
mthode de sparation des constituants dun mlange
gazeux, liquide ou solide. Cest une mthode de sparation,
donc danalyse, base sur les diffrences daffinits que
peuvent prsenter deux ou plusieurs composs pour deux
phases, lune fixe ou stationnaire et lautre mobile.
spectromtrie
infrarouge..
de
masse
ou
la
spectroscopie
Fluide porteur
(ou vecteur)
solut (lut)
PHASE
STATIONNAIRE
METHODE
CHROMATOGRAPHIQUE
Gaz
Solide
C.G.S
Gaz
Liquide
C.G.L
Liquide
Solide
C.L.S
Liquide
Solide
C.L.L
MECANISMES
METHODES
CHROMATOGRAPHIQUES
Adsorption
L.G.S et C.L.S
Partition
C.G.L et C.L.L
Echanges dions
C.L.S
Permations
C.L.S
I 3 - Historique
Il existe peu dexemple de dveloppement dun
procd ou dune mthode aussi extraordinaire que celui de
la chromatographie.
Quelques dates importantes:
1906: Dcouverte de phnomne chromatographique par M.
TSWETT
1952: Premire chromatographie gazeuse (MARTIN et
JAMES)
1967: Dbut de la chromatographie liquide haute
performance (HUBER et HUZSMAN)
I 4 - Buts de la chromatographie
Chromatographie analytique: analyses qualitatives et
quantitative (recherche, laboratoire, fabrication)
chromatographie prpara ive (recherche, synthse).
I 5 - Comparaison CG/CL
Les deux techniques de base de la
chromatographie ne sont pas comptitives mais tout
fait complmentaires.
Quelques avantages de la CL:
Possibilit de chromatographier: Produits thermolabiles
50
500
10000
2 millions et plus
II-THORIE DE LA CHROMATOGRAPHIE
La thorie gnrale de la chromatographie peut
tre longue et complexe exposer. En outre,
chaque mthode chromatographique possde sa
thorie et ses mcanismes propres. Nous
prsentons seulement dans ce chapitre les
grandeurs fondamentales de la chromatographie
(sous toutes ses formes) qui sont des lments
thoriques indispensables au praticien.
Vr = tr * D.
ou galement
(eq.1-3)
K = [Ss]/[Sm] (eq.1-5)
(eq.1-6)
La relation (eq.1-5) devient :
II-3-2- Le facteur de rtention k'
D'aprs (eq.1-3), on dduit que
(eq.1-7)
(eq.1-8)
(eq.1-9)
(eq.1-11)
EXERCICES D'APPLICATION
EXERCICE 1:
Les paramtres thermodynamiques des produits suivants ont t mesurs sur une
colonne capillaire ayant pour phase stationnaire un polysiloxane. Les termes
Het Scorrespondent aux variations d'enthalpie et d'entropie de dissolution
des produits entre la phase gazeuse et la phase stationnaire.
Quelle sera l'ordre d'lution de ces produits 120C ? Justifier votre rponse
par un calcul simple.
Hexyl actate
Butyl actate
Dcane
1-Heptanol
1-Bromobutane
Kj/mol
-47,2
-34
-36.9
-31
-42
S u.e
-75.4
-58
-58
-51
-66
SOLUTION 1:
Hexyl actate
Butyl actate
Dcane
GKj/mol
-.17,5
Ordre
d'lution
1-Heptanol
1-Bromobutane
-11,2
-14.1
-10.96
-16,06
EXERCICE 2:
Le chromatogramme de la nicotine a t obtenu dans les conditions suivantes :
CPG. Colonne remplie
Phase stationnaire: 10% Carbowax 20M/2%
KOH sur 80/100 Chromosorb W AW
Dimensions de la colonne: Longueur 6
(183cm) x 2mm (diamtre intrieur)
Dbit de la phase mobile: 20mL/min.
Quantit injecte:1L
Four: 200C. Temps de rtention de la nicotine = 3,20 mn
Four: 180C. Temps de rtention de la nicotine = 6,60 mn
Questions:
1- Calculer la vitesse linaire (en cm/sec) de la phase mobile dans la colonne.
2- En dduire le temps mort de cette analyse.
3-Calculer le temps de rtention de la nicotine 160C.
4- Peut-on luer la nicotine en 1 mn, sachant que la temprature limite
dutilisation de la colonne et de 250C?
SOLUTION 2
1- le dbit D = V/t = pr2L/t or la vitesse u = L/t do u = D/pr2
limite
d'utilisation
de
la
colonne
(250C)
(I)
Isotherme
Linaire
(II)
Isotherme
convexe
(III)
Isotherme
concave
Cs
cm
Temps
Trane en queue
Trane en tte
Temps
Quantit injecte
Figure 2: Les traits isothermes de distribution de base:
Ns2=(tr)2 (eq.2-3)
N augmente donc avec le temps de rtention et diminue si la largeur
des pics (s) augmente. D'aprs la relation 2-3, une bonne colonne
de chromatographie qui conduit des pics fins (s petit) pour des
temps de rtention (tr) levs, est donc caractrise par un nombre
de plateaux thoriques N lev..
Formule (eq.2-4) utilisant la base extrapole w du pic
Formule (eq.2-5) utilisant la largeur mi hauteur d du
pic
Formule (eq.2-6) utilisant la hauteur hp et l'aire A du pic
(w, d , hp, A et tr doivent tre exprims dans la mme unit).
H = L/N (eq.2-7)
CPG(colonnerempliede2m)
CPG(colonnecapillairede25m)
CPLclassiquede50cm
HPLCde10cm
Nombre de plateaux
thoriquesN
N/par mtre de
colonne
H(HETP)enmm
2000
1000
100000
4000
0,25
100
200
5000
50000
0,02
Exercice dapplication
Le chromatogramme de la nicotine a t
obtenu dans les conditions suivante:
Conditions
CPG. Colonne remplie
10% Carbowax 20M/2% KOH sur 80/100
Chromosorb W AW
6' (183cm) x 2mm ID . Dbit de la phase
mobile: 20mL/min. Inj.:1L
Four: 200C. Temps de rtention de la
nicotine = 3,20 mn. Four: 180C. Temps de
rtention de la nicotine = 6,60 mn
Questions:
1- Calculer la vitesse linaire (en cm/sec) de
la phase mobile dans la colonne.
2- En dduire le temps mort de cette analyse.
3-Calculer le temps de rtention de la
nicotine 160C.
4- Peut-on luer la nicotine en 1 mn, sachant
que la temprature limite dutilisation de la
colonne et de 250C?
5-Le pic de la nicotine a une largeur mihauteur de 10 sec. Calculez N et H.
Solution
1- le dbit D = V/t = pr2L/t or la vitesse u = L/t do u = D/ pr2 Application
numrique: u = 20// p(0,1)2 soit 636 cm/min ou 10,6 cm/sec
2- tm = L/u soit tm = 183/10,6 = 17,26 sec = 0,29 mn.
3- Pour la nicotine tr= 2,91 mn 200C et tr= 6,31 mn 180C , l'expression (eq.212) conduit 2 quations avec 2 inconnues.
ln(2,91) = A/473 + B et ln(6,31) = A/453 + B. La rsolution donne A=8408 et B=
-16,7, d'o tr= 15,44 mn T = 433K soit 160C
4- 250C soit T = 523K on obtient t'r= 0,53 mn soit tr= 0,82 mn.
5- N = 5,54(3,2*60/10)2 = 2042 plateaux thoriques et H = 1830/2521 = 0,90 mm
H = A +
B
+
Par exemple, dans un flux liquide, les molcules au centre du flux progressent plus
vite que celles qui sont sur les bords au contact des particules; on a B = 2 g Dm o
g est une constante (g<1).
et Dm est le coefficient de diffusion du solut dans la phase mobile.
Le terme B/u est videmment inversement proportionnel u. L'efficacit d'une
colonne augmente avec la vitesse de la phase mobile.Ceci peut expliquer les
bonnes sparations obtenues en HPLC; de plus, comme le terme Dm est environ 5
fois plus grand en CPG qu'en CPL, il en rsulte que la contribution de la diffusion
longitudinale est presque ngligeable en HPLC.
- VI-2.2 - Rsistance au transfert de masse.(Terme C)
Ce terme C*u reprsente la rsistance au transfert du solut entre les phases
mobiles et stationnaires, cette rsistance empche l'tablissement de l'quilibre
entre S(pm) et S(ps). Ce phnomne est du par exemple au fait que certaines
molcules stagnent dans les pores de la phase stationnaire.
Plus la vitesse (u) de la phase mobile diminue, plus les molcules de solut peuvent
pntrer dans la phase stationnaire, plus l'quilibre entre les 2 phases est favoris
et plus la colonne est performante.
Le terme C est proportionnel (dp2/Dm), les colonnes les plus efficaces seront
celles rgulirement remplies et bien tasses o le diamtre des particules est le
plus faible possible. Il faut galement utiliser des solvants de faible viscosit pour
minimiser ce terme
VI-2.3: Courbe de Van Deemter
La reprsentation graphique de l'quation (eq.2-8) est appele courbe de
Van Deemter
Soit une courbe de V.D. exprimentale, obtenue en HPLC, [ Int .Lab 30, 20 (2000)]; en
ordonne est reporte la hauteur de plateau rduite h = H/dp (o dp = 5 m est le
diamtre des particules. On considre deux points particuliers A et B sur cette courbe.
1- Au point A (dbit = 1 ml/mn, U = 0,65 mm/s et h = 2), calculer le temps mort et le
temps d'analyse.
2- Mme question au point B (dbit = 2,75 ml/mn, U = 1,7 mm/s et h = 2,5).
3- Calculer la perte d'efficacit de la colonne entre A et B (NB/NA ). Conclusion
Solution:
1- tm= L/u soit 230 s = 3,83 mn; tA= tm(1+k') = 708 s = 11,80 mn
2- tm= 88,23 s = 1,.47 mn; tB= 271,76s = 4,5 mn
3- NB/NA= hA/hB= 0,.8 . En conclusion, N diminue un peu car il est multipli
par 0,8 mais le temps d'analyse diminue normment car il est divis par 2,6.
Il peut donc s'avrer plus "rentable" de faire l'analyse au point B qu'au point
A.
(quV9)
(quV10)
V-1: Interprtation thermodynamique du facteur de sparation.
En utilisant (eq.V-9), on peut exprimer le facteur de sparation a en fonction
des coefficients de partition (ou constantes d'quilibre K) des soluts A et B:
(quV11)
q. V-15
Figure V-2. Influence du terme R sur la sparation de deux pics d'intensit gale
eq v- 16
Annexe: Dmonstration de la formule de Purnell.
car wA
et
d'o
t(B) =tr(B)
et
en multipliant par
on obtient
d'o
Or
eq v- 16
EXERCICE D'APPLICATION
Sur une colonne HPLC (phase stationnaire : C18), 15cm x
4,6mm, remplie de particules de 5m, avec lactonitrile
(CH3CN) comme phase mobile et une temprature de
30C, on mesure un temps mort de 1,07 mn.
Dans ces conditions, on obtient la sparation ci-contre
entre les 2 amphtamines :
Amphtamine (A) :
temps de rtention = 2,40 min,
largeur du pic mi-hauteur = 5 sec.
Methamphtamine (M) : temps de rtention = 2,85 min,
largeur du pic mi-hauteur = 6 sec.
1- Calculez le facteur de sparation
2- Calculez le facteur de rsolution R
3- valuez le nombre de plateau thorique de la colonne N
4- Calculez la diffrence dnergie libre de dissolution d (G)
entre ces 2 produits dans la phase stationnaire (R = 8,31 J K-1
mol-1)
Solutions:
1- k'(A) = 1,243 et k'(M) = 1,664 d'o a = 1,338.
2- R= 1,118
3- N= 5390 plateaux thoriques d'aprs Purnell
4- d (G) = -RTln(a) = -733 J /mol