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TECNOLOGIA DE

PRODUO DE VACINAS
Aline Richter, Gabriella Ricarte e Mariana Pisani

Apontamento histrico

Sculo XVIII:
variolizao (chineses)
As tcnicas diferiam:
algodo, com p de crostas
ou pus inserido no nariz,
vestir roupas ntimas de
doentes, incrustar crostas
em arranhes, picar a pele
com agulhas contaminadas,
fazer um corte na pele e
colocar um fio de linha
infectado ou uma gota de
pus.

Apontamento histrico

Edward Jenner
(1796)
Cowpox
O mito das ordenhadoras
imunes
Imunizao de James
Phipps pelas pstulas de
uma ordenhadora que
possua cowpox.
Inoculao com o pus
varioloso.
Descoberta da vacina.
vacalizao

Apontamento histrico

Louis Pasteur
(1885)

Vacina anti-rbica
Imunizao com as
clulas da medula de
um coelho infectado.
Desenvolveu
imunizantes contra a
clera das galinhas e
o carbnculo do gado.

Emile Roux e
Alexander Yersin
(1888)
Descobriram que o
bacilo da difteria
produzia uma toxina
poderosa, responsvel
pelos sintomas da
doena.
Em 1891, Emil Behring injetava doses subletais
desta toxina, provocando o aparecimento de
molculas antitxicas (anatoxinas), capazes de
proteger contra a infeco e de ser transferidas
para outros animais, imunizando-os.

Apontamento histrico

E. Loewenstein e
Alexander
Glenny(1904)

Provaram que toxinas


poderiam ser inativadas
por substncias qumicas,
no caso formol, mantendo
seu potencial imunizante,
mas sem causar infeco.
Essa descoberta levou ao
desenvolvimento dos
primeiros toxides:
diftrico e tetnico.

Louis Sauer,
Pearl Kendrick
e Grace
Eldering
(1942)

Imunizantes contra coqueluche.

Kendrick descobriu que sua vacina


funcionava melhor na presena dos
toxidesdiftrico e tetnico, combinouos ento para formar a vacina DPT ou
trplice bacteriana a primeira a
imunizar contra mais de um
microorganismo.

Apontamento histrico

Jonas Salk(1949)
Vacina a partir de vrus
inativados (mortos). Foi
o primeiro imunizante
no mundo a ser
produzido em cultura de
tecidos (clulas de rim
de macaco) e reunir
mais de uma subespcie
de vrus (poliovrus I, II e
III).

Albert Sabin(1954)
Vacina atenuada contra a
plio, a primeira a ser
aplicada por via oral. Por
mimetizar o mecanismo
de infeco do vrus
selvagem, com a excreo
do microorganismo
atenuado no ambiente, a
vacina Sabin facilita a
obteno de altos nveis
de imunidade coletiva.

Principais desafios atuais para a imunizao :

Baixo interesse da indstria farmacutica (vacinas


representam apenas 2% do mercado mundial)
Labilidade dos produtos
Risco da responsabilidade por reaes adversas
Alto custo de desenvolvimento
Limitada capacidade de compra dos pases alvos

Principais vantagens da imunizao :


Alto custo benefcio para a sade pblica

Produo de vacinas

Fase biolgica (preparao de antgenos)


Cultura de microrganismos
Purificao
Atenuao ou inativao

Produo de vacinas

Fase farmacutica

Obteno do produto final para utilizao

Produo de vacinas

Transporte e distribuio
Cadeia de frio: Assegurar a estabilidade
da vacina em todas as etapas.
Temperatura: 2C a 8C

Produo de vacinas

Ciclo de produo: 6 a 22 meses


70% do tempo total ocupado pelo
controle de qualidade
So necessrios mais de 50 testes de
controle durante a produo de um lote
de vacina
14 dias para realizar um controle de
esterilidade

Os principais tipos de vacinas:

Vacinas vivas atenuadas


Compostas de microrganismos vivos atenuados em
laboratrios
Capazes de multiplicarem-se no organismo hospedeiro
Resposta imune ao microorganismo atenuado
idntica a produzida pela infeco natural
O sistema imune incapaz de diferenciar entre uma
infeco pelo microorganismo vacinal e o
microrganismo selvagem.
A multiplicao do microorganismo vacinal no
costuma ser capaz de causar doena.

Os principais tipos de
vacinas:

Vacinas vivas atenuadas:

Mtodos fsicos de atenuao:

Sarampo,caxumba,rubola, plio, febre


amarela, varicela,BCG.
Calor e radiao UV

Mtodos qumicos de atenuao:

Formaldedo e Agentes alquilantes (propiolactona, etieneimina)Ligam


cruzadamente as cadeias de cido nuclico

Os principais tipos de
vacinas:

Vacinas inativadas

Compostas de microrganismos inativados.

No mais se encontram vivos so incapazes de multiplicarem-se.

Resposta imunolgica limitada.

Aplicadas em doses consecutivas

Exemplos de vacinas inativadas:DPT ,hepatite A,hepatite


B,raiva,meningococo,influenza, haemophilus do tipo-b, febre
tifide, clera

Vacina viva:
A primeira injeco permite ao
vrus multiplicar-se rapidamente,
desencadeando uma resposta
imunitria em larga escala com
produo de anticorpos e resposta
de linfcitos T.
Prs e contras:Apenas
necessria uma dose mas existe
um risco mnimo de
desenvolvimento da doena.

Vacina morta:
Uma vacina morta no pode
multiplicar-se e a resposta dos
anticorpos limitada. Duas
injeces adicionais administradas
posteriormente asseguram uma
produo suficiente de anticorpos.
Prs e contras:No existe risco

Os principais tipos de
vacinas:
Vacinas de subunidades:

As vacinas de subunidades usam apenas as partes do


microrganismo para estimularem o sistema imunitrio.
Ao conter apenas o que necessrio para uma resposta e no
todas as outras partes do microrganismo, as vacinas de
subunidades tendem a causar menos reaces adversas.

Vacinas de toxides:

Com algumas doenas bacterianas, tais como a difteria e o


ttano, o problema no so as bactrias propriamente ditas mas
as toxinas que produzem.
Em vez de conterem um antigno microbiano, as vacinas de
toxides contm toxinas inactivadas, denominadas toxides.
Este tipo de vacinas estimula a produo de anticorpos. Quando
uma pessoa infectada, estes anticorpos podem bloquear a
entrada das toxinas nas clulas.

Os principais tipos de
vacinas:

Vacinas recombinantes:

HEPATITE B

O desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante o primeiro a


sercomercializado foi a vacina contra hepatite B.
O primeiro passo a seleo de um pedao do
genoma do vrus, capaz de estimular o sistema de defesa do
organismo,
mas no de infectar e causar a doena. Utilizando ferramentas da
engenharia gentica, esta seqncia inserida num microorganismo
no patognico para o homem (no caso, o fungo Saccharomyces
Cerrevisae ou a bactria Escherichia coli). Assim, o micrbio vetor
passa a expressar (produzir) uma protena do vrus da hepatite
B(antgeno de superfcie), provocando a formao de anticorpos.

Metodologia tradicional de
atenuao

Metodologia para
produo de vacinas
recombinantes

Associao em leveduras:

Vacinas Vetorizadas:

Vacinas Bacterianas

As vacinas bacterianas podem ser


produzidas a partir de:
Microrganismos atenuados ou mortos
Toxinas neutralizadas
Componentes de cpsula, membrana ou
parede bacterianas
Cultivo esttico ou submerso
Cultivo submerso: Bactrias mais
resistentes liofilizao

Vacinas Bacterianas

Vacinas Virais

Reproduo do vrus em cultura in vitro


de clulas animais ( ex: rim do macaco )
Cultivo esttico
Cultivo submerso

Vacinas Virais

Cultivo esttico:
Clulas crescem sem agitao at que
toda a superfcie do meio fique coberta
Inoculao do vrus
Propagao
Separao, purificao, inativao ou
atenuao do vrus
Desvantagem: Maior risco de
contaminao

Vacina contra a gripe


Multiplicao do vrus

Retira-se o
lquido que foi
formado

Testes

Limpeza e
tratamento

Esta tcnica pode ser utilizada para produo de outras vacinas


virais, porm no usada para vacinas que so de origem
bacteriana. Um ovo produz 1 dose de vacina

Vacinas Virais

Cultivo submerso:
Em biorreatores
Agitao constante do
meio
Condies
homogneas
Problemas:
Clulas no se
multiplicam livremente
Acmulo de
subprodutos

Vacinas Virais

Vantagens do uso de biorreatores:


Produo em larga escala
Reduo de custos
Maior eficincia na produtividade
Condies timas (pH, T, O2 dissolvido)
Maior uniformidade nos lotes de vacina

Vacinas Virais

Objetivo

Nesse trabalho descrito um processo


para a produo de vacina humana do
vrus H1N1 atravs de clulas MDCK
(Madin-Darby canine Kidneys) em meio
de cultura (DMEM) contendo soro,
usando um biorreator de leito recheado.

Materiais e Mtodos

Clulas

MDCK clulas foram cultivadas:


T=37C
Meio

de Cultura: DMEN com alta concentrao


de glicose, suplementado com 5% de soro fetal
bovino (FBS) e 3,7 g/L de NaHCO3

Materiais e Mtodos

Vrus

A cepa do H1N1 foi repicada 3x nas clulas


MDCK contendo o meio DMEM sem FBS e
com tripsina
A produo de vrus foi medida pela
titulao expressa por unidade de
hemaglutinina viral(HA) ou TCID50/mL
O vrus foi armazenado em alquotas de
10mL (6,5x10^7 TCID50/mL) a -80C

Materiais e Mtodos
Sistema rotativo de cultura e Frascos T
As clulas foram descongeladas diretamente no frsco T-75
contendo DMEM com 5% de FBS.
Depois de 3 dias uma parte foi transferida para frascos T150 (50ml) e foram cultivadas a 37C em uma incubadora
de 5% C02
Em um sistema rotativo (850cm2) culturas foram
inoculadas com 2.5x10^7 clulas e cresceram por 3 dias
Quando havia 1,0-1,2x10^8 clulas, foi adicionado o
DMEM sumplementado com 2.5 um/mL de TPCK-treated
tripsina
A ao da tripsina foi parada com um volume equivalente
de DMEM com 5% de FBS
A suspenso de clulas foi usada para inocular a cultura de
ACPB.

Materiais e Mtodos

Mini-Biorreator

Ao AmProtein mini-biorreator (ACPB) selfrotatin foi adicionado 0,6g de carriers de


polimeros de fibra de papel para otimizar
as condies de crescimento

Materiais e Mtodos

Mini-Biorreator

Estudo da relao entre densidade celular e


GCR
14

mini-bioreator
6x10^6 clulas incubadas em 30ml de meio
completo
T=37C com 5% de CO2
Velocidade mantida a 45rpm
O meio no mini-bioreator era trocado
diariamente
2 vasos eram removidos por dia para
determinar densidade celular e concentrao
de glicose

Materiais e Mtodos

Mini-Biorreator

Determinao do efeito de diferentes


concentraes de MDCK
4

grupos foram testados contendo: 2x10^6 ,


4x10^6, 6x10^6 e 8x10^6 clulas em 30ml de
meio completo a 37C e 5% de CO2.
O meio de cultura foi trocado diariamente
Cada grupo foi testado 2x e a mdia foi calculada
Amostras foram retiradas do bioreator em
intervalos de 12h durante o crescimento celular
e a produo do vrus

Materiais e Mtodos

Otimizao de parmetros de infeco

Determinar o efeito do inculo e da Tripsina


na produo da vacina.
8

grupos contendo 2x10^6 clulas foram


testados
1
2
3
4
5
6
7

Tripsina
(m/mL)

2,5

2,5

2,5

2,5

1,0

2,5

5,0

10,0

MOI

0,5

0,1

0,05

0,01

0,05

0,05

0,05

0,05

Cada

grupo foi testado 2x e a mdia foi


calculada

Materiais e Mtodos

Cultura no ACPB

A coluna de perfuso foi preenchida


com150g de carriers, PBS (20mM, 6L) foi
bombeado nela pela noite
O PBS foi substitudo pelo meio de cultura e
as clulas (5x10^8 celulas/L, 4L) do
sistema rotativo de cultura foram
adicionados ao recipiente de alimentao,
transferido para a coluna de perfuso e
incubado por 1h sem agitao.

Materiais e Mtodos

Cultura no ACPB

Condies de operao do bioreatror:


T=37C
Velocidade

de rotao= 55rpm
pH=7,4 dissolvendo CO2 e 7,5% NaHCO3
A taxa de circulao = 150mL/min
O2 dissolvido foi mantido a 40% da saturao
do ar, dissolvendo ar e N2

Materiais e Mtodos
Cultura no ACPB

Depois

de 6 dias o meio de cultura foi removido e o


bioreator foi lavado 3x com 4L de PBS
Vrus (MOI=0,05) em 10L de DMEM suplemendado
com 2,5m/mL de Tripisina foram adicionados ao
bioreator
Condies de operao na infeco e propagao do
vrus foram as mesmas do crescimento das clulas
MDCK com exceo da temperatura que foi mantida a
34C

Materiais e Mtodos

Amostras e Anlises

Amostras do ACPB foram retiradas em intervalos de 12h


durante o cescimento celular e a produo do vrus
Concentrao de clulas e sua viablidade no sistema
rotativo e nos frascos T foram medidas usando o mtodo
Trypan Blue dye exclusion com um hemacitmetro.
Concentrao de clulas no mini-bioreator e no ACPB
foram medidas usando crystal violet staining
A concentrao de glicose foi medida usando YSI 7100
A titulao d HA foi feita em microplacas 96well com
clulas vermelhas do sangue de peru
A concentrao do vrus foi determinda com TCID50 nas
MDCK.

Resultados

Expanso celular e preparao para a


inocilao no ACPB

Resultados

Determinao de GCR on mini-bioreator

O crescimento celular foi proporcional ao


GCR

Resultados

Determinao de GCR no mini-biorreator

Resultados

Otimizao dos parmetros de infeco


no mini-biorreator
Optimization of
the infection
parameters in
mini-bioreactor
vessels. a
Influence of
different MOI on
virus yield in the
minibioreactor
vessels: MOI
0.01(white), 0.05
(light gray), 0.1
(gray), 0.5
(black).

Resultados

Otimizao dos parmetros de infeco


no mini-biorreator
Foi usado
2,5m/mL de
tripisina com
0,05 MOI para
expanso do
vrus no ACPB
Influence of
different trypsin
concentrations (0,
1, 2.5, 5, 10
g/ml) on virus
yield in the minibioreactor vessels

Resultados

Cultura no ACPB

Densidade
celular
2,2x10^8g/

Resultados

Cultura no ACPB
TCID50(ma
x)=
7.3x10^7/
mL em 96h

Resultados

Cultura no ACPB

Os resultados foram
semelhantes em
outros experimentos

Discusso

A concentrao de tripisina um fator crtico para uma


produo eficiente de vacina de gripe a partir de clulas
MDCK

A adio de 2,5m/mL de tripisina no mini-bioreator


apresentou um aumento na produo do vrus em 3 dias

A concentrao do inculo tambm importante para a


produo eficiente de vacina de gripe a partir de clulas
MDCK

Altos MOI aumentam a proporo de partculas sem vrus ou


com vrus no-infectuosos
Baixo MOI diminue a produo do vrus
Nesse estudo foi escolhido utilizar MOI=0,05 que corresponde
com a mxia produo de vrus no mini-bioreator

Discusso

Nesse artigo foi apresentado um processo para a


preduo de vacina para gripe usando meio DMEM
contendo soro(FBS) em um biorreator de leito
recheado (ACPB).
O mini-biorreator foi usado para o estudo da relao
entre a densidade celular e GCR, alm de
estabelecer parmetros para a produo do vrus da
gripe H1N1
Depois da otimizao o total de clulas aumentou de
2,0x10^9 para 3,2x10^10 depois de 6 dias.
A utilizao desse biorreator com bolsas
discartveis dispensa a limpeza, diminuindo o tempo
de operao o que pode viabilizar o processo.