VIROLOGA

DIAGNSTICO VIROLGICO.- MTODOS

INDIRECTOS O SEROLGICOS
DOCENTE: CARMEN MOSQUERA
STEPHANIE CAROLINA ROMERO RAMREZ
GRUPO 7

MTODOS INDIRECTOS O
SEROLGICOS
Consiste en demostrar en el suero del
paciente la presencia de anticuerpos
especficos antivirales.
Dos mtodos: conversin
serolgica y presencia de IgM
especfica.
Conversin serolgica.-aparicin
de Anticuerpos mas de 4 veces
en dos muestras pareadas

Deteccin de IgM especfica.diagnstico de infeccin reciente

en una sola muestra de suero

INMUNOFLUORESCENCIA
INDIRECTA
Diagnstico serolgico
Uso de anticuerpos especficos
anti-Igs humanas conjugados con
colorantes
fluorescentes
(fluorescena u otros)
Detectar fcilmente en el suero
del paciente la presencia de
anticuerpos antivirales.

Permite detectar la
presencia de antgenos
virales en el interior de las
clulas mediante tincin
con anticuerpos especficos
conjugados con un
colorante fluorescente

Inmunofluorescencia indirecta
para deteccin de anticuerpos
Hacer reaccionar los anticuerpos
presentes en el suero con
antgenos virales presentes en
clulas infectadas fijadas sobre
portaobjetos y revelar esa unin
antgeno-anticuerpo mediante un
segundo anticuerpo anti-Igs
humanas, conjugado con
fluorocromo.
El fluorocromo mas usado
es el isotiocinato de
florescena

INMUNOFLUORESCENCIA
La IFI suele ser mas sensible y
mas especfica que la directa
debido a que tiene un paso
mas de amplificacin, por lo
que requiere 1-2 horas para
su realizacin

Requiere de solo un
reactivo marcado, la
globulina gamma
antihumana de cabra
conjugada con
fluorescena

Inmunofluorescencia indirecta
para deteccin de IgM
Se utiliza para el
diagnstico de infeccin
reciente y para
diagnstico de
infecciones congnitas.
Pueden falsos
resultados:

Factores
reumatoideos(FR)

Altos ttulos de IgG

especfica

Los diferentes tipos de ELISA son:

Anticuerpos marcados:
ELISA Directo
ELISA Indirecto
ELISA sndwich
Doble (DAS)
Heterlogo (HADAS)

Antgeno marcado:
o ELISA competitivo

Elisa de captura
ELISA Sndwich DAS
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin
al
soporte
insoluble
de
anticuerpos especficos
del agente
patgeno a detectar.
Adicin de la muestra problema (extracto
vegetal, sangre, suero, plasma, etc.).
Adicin de anticuerpos especficos del
antgeno a detectar.
Adicin de un substrato sobre el que sea
capaz de actuar la enzima marcadora.
Lectura visual o colorimtrica
producto final coloreado.

del

ELISA Sndwich HADAS

Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a
detectar.
Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.).
Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar.
Adicin de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos
empleados en el paso anterior.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

ELISA COMPETITIVO
Consta de las siguientes etapas:
o Fijacin al soporte insoluble de
anticuerpos
especficos
del
agente patgeno a detectar.
o Adicin
en
concentracin
conocida de una mezcla de
antgenos
del
anticuerpo
utilizado en el paso anterior.
o Adicin de un substrato sobre el
que sea capaz de actuar la
enzima marcadora.
o Lectura visual o colorimtrica
del producto final coloreado de
ambas pruebas y comparar los
resultados.

WESTERN BLOT
Javier Agustn Lanez Mite
Grupo 7 Cuarto Semestre

Definicin
Western Blot es una tcnica analtica,
ampliamente utilizada en biologa celular y
molecular,
para
la
separacin
e
identificacin de protenas.
En virologa sirve para investigar antgenos
virales o sus respectivos anticuerpos.

Capacidad de identificar
protenas especficas de
una mezcla compleja de
protenas extradas de
las clulas.

Similar a ELISA
WB menos sensible
WB ms especifico
Prueba confirmatoria de la presencia de Ac para HIV en
suero de pacientes con serologa positiva determinada
por ELISA

cmo funciona?
Las protenas de la muestra se separan mediante
electroforesis en gel en funcin de su peso molecular.
A continuacin se utiliza un anticuerpo especfico para
detectar la protena de inters.
El resultado aporta informacin sobre el peso molecular
de la protena y su cantidad relativa en la muestra.

Secuencia
Preparacin del
tejido

Electroforesis en
gel

Bloqueo

Transferencia

Deteccin

Anlisis

Preparacin de la muestra
Muestra:
Tejido
Cultivo celular
Extraccin de las protenas de muestras biolgicas
mediante disrupcin mecnica o qumica.

Mecnic
o

Qumic
o

Licuadora(para
grandes volmenes
de muestra)
Homogenizador(para
muestras pequeas)
Sonicacin.

Detergentes
Sales
Tampones
(favorecen la lisis y
solubilizan las
protenas)

ELECTROFORESIS
Para entender la tcnica del Western Blot es necesario
comprender que es una electroforesis y en que se basa.
Las protenas suelen tener carga neta; por lo tanto, si se aplica un
campo elctrico a una solucin que contenga una mezcla de
protenas, stas migrarn a una velocidad que depender de su
carga neta, forma y peso molecular. Esta tcnica es conocida
como electroforesis.
Las separaciones electroforticas se realizan casi siempre en
soportes slidos, generalmente para separar una mezcla de
protenas, el soporte de eleccin son los geles de poliacrilamida.

Secuencia del Western blot Paso 1

Paso 1
Electroforesis de las muestras de protenas:
-Las protenas se desnaturalizan con calor, SDS y sustancias
como beta mercaptoetanol o ditiotreitol que rompen puentes
-S-S-El SDS aporta cargas negativas
-Las protenas corren hacia el nodo (+) y se
distribuyensodico
en el
Dodecilsulfato
gel de acuerdo a su peso molecular

Muestra de protenas para

cargar en el gel

Fuente de poder

Protenas ya corriendo en el
gel

Electroforesis en gel
En esta tcnica la mezcla de protenas se separa
mediante una electroforesis en gel, con base en:
o Peso molecular
o Estructura
o Hidrofobicidad

65mm altura Gel de

corrida

Cubeta de electroforesis

transferencia
Estos resultados son luego transferidos a una
membrana adsorbente produciendo una banda para
cada protena.
Para que las protenas sean accesibles a la deteccin
por anticuerpos.
Membrana denitrocelulosao dePVDF.

Esta transferencia puede realizarse por:

Difusin
Porvaco
Por accin de un campo elctrico (electrotransferencia).

Buffer de transferencia

Se construye lo que se conoce como

sndwich,
donde
se
apilan
sucesivamente una esponja plana,
papel
absorbente,
el
gel,
la
membrana sinttica, ms papel y
finalmente otra esponja plana.

Secuencia del Western blot

Transferencia a la membrana de nitrocelulosa: Paso- 2
-Las protenas separadas por tamao se transfieren desde el gel a una membrana de nitrocelulosa
-Otra vez se aprovecha la carga negativa de las protenas

Se detiene la corrida electroforetica

Se quitan las burbujas para asegurar

la correcta transferencia

Se desarma con cuidado la cuba electroforetica para liberar

el gel con las proteinas separadas por masa

Armado del cassette de transferencia

El gel con las protenas se coloca en el cassette de transferencia

Cassette listo para iniciar transferencia

VERIFICACIN
Tras la transferencia, se suele proceder a la tincin del
gel conCoomassie Brilliant Blue(un colorante de
protenas) para comprobar que en efecto una parte
importante del material proteico ha pasado a la
membrana.
No se deberan observar protenas coloreadas en el Gel,
lo que nos dara a entender que todas las protenas se
transfirieron.

bloqueo
Puesto que la membrana escogida necesita poder
unirse protenas de forma inespecfica, es preciso
bloquear los lugares de unin que han quedado libres
tras la transferencia.
En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza
proteica) empleado en la deteccin puede unirse a
ellos, dificultando la distincin delcomplejo antgenoantgenoque se forma con la protena que se busca.

 En el bloqueo se incuba la membrana con una solucin

de protenas:
Albmina de suero bovinoo ASB (ms conocida por sus siglas
en ingls, BSA)
Leche en polvoo casena
Diminuta fraccin de detergente (Tween 20oTritn X-100)
Se evita falsos positivos.

deteccin
Posteriormente la membrana se incuba con anticuerpos
especficos marcados para la protena de inters.
Comprueba la presencia en la membrana de una
determinada protena. Para ello se emplea un
anticuerpoespecfico contra ella unido a enzima que, en
presencia de su sustrato, catalice unareaccin
colorimtrica. De esta forma, se hace patente la unin
con elantgeno, la protena, as como su localizacin.

Estos lavados son necesarios para eliminar los excesos de reactivos no unidos

Producto Insoluble

TIPOS
Se puede hablar de tipos de western blot segn el tipo
de deteccin de las protenas.
Directo:
El anticuerpo primario marcado se une al antgeno de la
membrana y reacciona con el sustrato originando una
seal detectable. En el mtodo directo de deteccin, el
anticuerpo primario que se utiliza para detectar el
antgeno sobre la superficie de la membrana, debe ir
marcado con una enzima

MTODO DIRECTO

Indirecto
El anticuerpo primario sin marcar reacciona con el
antgeno. Luego, un anticuerpo secundario marcado se
une al primario y reacciona con el sustrato. En el
mtodo indirecto, se aade primero un anticuerpo
primario sin marcar contra el antgeno de la superficie
de la membrana; posteriormente se aade un
anticuerpo secundario marcado contra el anticuerpo
primario.

MTODO INDIRECTO

MTODOS DE DETECCIN

anlisis
Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se
procede a la deteccin de aquellas que s se han unido
a la protena de inters.

CUANTIFICACIN

Es muy importante ser consciente de que los datos

producidos con un western blot se considera
generalmente para ser semi-cuantitativa.
Debido a que proporciona una comparacin relativa de
los niveles de protena, pero no una medida absoluta de
la cantidad.

 Hay dos razones para esto;primero, hay

variaciones en los tipos de carga y de transferencia
entre las muestras en carriles separados que son
diferentes en transferencias separadas.
En segundo lugar, la seal generada por la
deteccin no es lineal en todo el intervalo de
concentracin de muestras.
Por lo tanto, puesto que la seal producida no es
lineal, no debe ser utilizado para modelar la
concentracin.

aplicaciones
Investigacin
Biologa molecular.
Inmunologa.

Diagnstico
Prueba de VIH.
Enfermedad de las vacas locas.
Enfermedad de Lyme.

Et
a
p
a

TAMIZAJE SEROLOGICO
ELISA
Negativo

Positivo/Indeterminado
Repetidamente

Correr una nueva

muestra

Repetidamente
POSITIVO

(1)
Et
a
p
a

WESTERN BLOT
Negativo

Indeterminado
Correr una nueva muestra 30 a 60 das
despus

(2)
Repetir etapas 1 y 2

Positivo

WESTERN BLOT
(TEST CONFIRMATORIO)

TEST DE WESTERN BLOT

Objetivo- Detectar anticuerpos especficos contra el VIH1/2

Fundamento
Lisado viral de clulas infectadas, sometidos a
electroforsis en gel de poliacrilamida y transferido a hojas
de nitrocelulosa

Criterios de interpretacin
POSITIVO
- Si dos bandas presentan intensidad >1+ en relacin
al control ,
- Una banda de envoltura y la p24
- Presencia de bandas gp120, gp41, p31, p24 y p17
para HIV1
- Protenas gp105 y gp36 para HIV2
3+ 1+ +/-

Control
gp120 gp41 p31 p24 p17

gp105 gp36

Criterios de interpretacin

INDETERMINADO
- Si dos o mas bandas presentan intensidad +/- Si una banda presente intensidad <1+ y el resto son negativos en
relacin al control
3+ 1+ +/-

Control

Gp120

p24

NEGATIVO
Si todas las bandas presentan valoracin <+/ Ausencia de protenas
3+ 1+ +/-

Control

Inmunoperoxidasa
Detecta antgenos virales en muestras clnicas que
contengan tejidos y clulas.
En utilizar como marcadores enzimas capaces de hacer
cambiar de color un sustrato incoloro.
En la especificidad de la reaccin antgeno-anticuerpo,
que permite la identificacin de una protena (el
antgeno), cuya presencia queremos demostrar,
mediante su unin a un anticuerpo especfico

ENZIMAS UTILIZADAS

Estos marcadores pueden unirse directamente al anticuerpo primario o bien

indirectamente mediante otros anticuerpos o sustancias como biotina o
protena A.

Proceso de la tcnica

ganglio linftico de rata

los puntos o clulas donde se localiza el

antgeno aparecen de color marrn

DOT BLOT
Dot Blot es una tcnica de biologa molecular para detectar
biomolculas.
En un dot blot las biomolculas para ser detectados no son
separadas por cromatografa. En cambio, una gota que
contiene la molcula para ser detectada se aplica
directamente sobre una membrana. Esto es seguido por la
deteccin por sondas de nucletidos (northern blot y
southern blot) o anticuerpos (para un western blot).
El procedimiento del Slot y Dot Blot son casi iguales pero en
el primero el filtro es a travs de pequeas ranuras.

Equipo de DOT BLOT

Armado:
1. Tapa inferior
2. Membrana selladora
3. Membrana de Nitrocelulosa
4. Tapa superior
5. Ajuste de los tornillos

-Volumen Total PCR: 100 l

Preparacin de los productos a transferir:

Para sembrar un punto del dot blot:

Producto de PCR: 10 l
EDTA 100 mM

50 l

NaOH 2N

40 l

Agua

100 l

X8

Producto de PCR: 80 l
EDTA 100 mM

400 l

NaOH 2N

320 l

Agua

800 l

Teniendo en cuenta cuntos sondas vamos a probar y cuntas muestras se van a

analizar, hacer los clculos necesarios para TODOS los dot blots, multiplicando
los volmenes anteriores por el nmero de sondas + 1. En este ejemplo, se
usaron 7 sondas
x 8.

1- Tomar tantos tubos eppendorf grandes como muestras.

7
2- Preparar las mezclas calculadas antes
a membranas.
Preparacin de la membrana:
Se utilizan membranas
de NITROCELULOSA
Cortar un rectngulo de 12 x 8 cm
trabajando siempre con guantes.

Hidratar 30 minutos con agua destilada y

luego equilibrar durante 5 minutos en buffer
SSPE 20X, pH 7,4.

muestras listas para transferir

Siembra de las Muestras- Dot Blot:

HYBRI-DOT MANIFOLD, BRL (Gibco)

+
membrana

Colocar la plancha inferior del aparato, conectar a

la bomba de vaco. Identificar un extremo de la
membrana con un corte.

Utilizando guantes, colocar la membrana

sobre la plancha inferior.

Colocar la plancha superior y ajustar perfectamente los tornillos en forma enfrentada.

Encender la bomba de vaco y verificar que sta elimina el lquido remanente del lavado de
la membrana.
En cada punto de siembra colocar sucesivamente 200 ml de dilucin de cada
producto de amplificacin y 200 ml de SSPE 20X

7 8

Finalizada la siembra, y luego que la bomba elimin todo el lquido, colocar la

membrana entre dos papeles Whatman y sellarlos con una cinta. Secar durante una
hora a 80 C en estufa (o por cross linker)

Southern blot
permite detectar la presencia de una secuencia de ADN
en una mezcla compleja.

Pasos para un Southern blot

Northern Blot
Tcnica de deteccin de molculas de cido ribonucleico
(ARN) de una secuencia dada dentro de una mezcla
compleja (por ejemplo, un ARN mensajero para un
pptido dado en una muestra de ARN total).

Pasos de la tcnica

Diferencias

Inmunodifusin

 Se procede a colocar 5
micro litros de suero
control y del suero
problema en diferentes
pocillos de la placa de
agarosa
El fin es tener las 3 placas
de agarosa con sueros
control y problema

-Es importante poner las

concentraciones especificas del
suero control en la hoja de datos
-Luego se procede a la
incubacin de las placas en una
cmara hmeda a temperatura
ambiente

 En este tiempo (3 das) las

Inmunoglobulinas van a
difundirse por la placa de
agarosa, entrando en contacto
con sus correspondientes
antgenos
Esta interaccin forma anillos de
precipitacin visibles al ojo
humano

La lectura de la muestra se hace

con la lupa, en la cual se mide el
dimetro del halo de precipitacin

-Se procede a colocar los

dimetros de cada halo en las
tablas
-Se cambian los dimetros por
concentraciones usando la tabla
de referencia
-Se observa finalmente la
concentracin de alguna
Inmunoglobulina aumentada
dependiendo del estado de
infeccin del paciente

PCR ( REACCION EN CADENA DE

LA POLIMERASA
Permite amplificar selectivamente
secuencias de ADN o ARN luego de la
sntesis de ADN complementario
mediante transcripcin reversa

Kary Mullis Ganador del premio nobel de

quimica en 1993 por esta tecnica

Grandes cantidades de ADN de

longitud y secuencia definidas, a
partir de pequeas cantidades de un
complejo templado

Con la amplificacion resulta mas facil

identificar virus o bacterias causantes de
enfermedades

Muestra clnica

Fundamento de la
PCR
Amplificacin enzimtica de un
fragmento de ADN flanqueado

2 oligonucleotidos cebadores ( primers ) que hibridan con las

cadenas opuestas de la secuencia nucleotida de inters (secuencia
blanco )

Tres tipos de informacin

1.- Presencia de la secuencia blanco
2.- distancia entre los cebadores
3.- secuencia nucleotida entre los cebadores

Una vez obtenido el templado de ADN

-

Gen de interes
Cebadores
Nucleotidos
ADN polimerasa termoestable

Se lo deposita en el
termociclador

Ciclo de desnaturalizacin
( a 95 C )

Punto de partida para

replicar el ADN

Hibridacin o Anillamiento
Hibridacin de los cebadores a las
secuencias complementarias ( a 55
- 65 C )

Extension o elongacion
Extension nucleotidica de dichos
cebadores mediante la accion
enzimatica de una ADN polimerasa
termoestable

Ciclo 2

Ciclo 3