Validao de metodologia na rea qumica

Procedimento prtico de validao de mtodos analticos

fsico-qumicos
Shirley Abrantes
14 a 16 de outubro de 2003
V Encontro do Instituto Adolfo Lutz-Centro de Convenes Rebouas-So Paulo/SP
e. mail: shirley@incqs.fiocruz.br

Contedo

1- Planejamento de validao
2- Como proceder para determinar as caractersticas de desempenho de mtodos
2.1- Aplicabilidade
2.2- Faixa de trabalho
2.3- Linearidade
2.4- Faixa linear de trabalho
2.5- Sensibilidade
2.6- Homocedasticidade/heterocedasticidade
2.7- Limite de deteco
2.8- Limite de determinao/quantificao
2.9- Exatido/recuperao
2.10- Preciso
2.10.1- Repetitividade
2.10.2- Preciso intermediria
2.10.3- Reprodutibilidade
2.11- Seletividade
2.12- Robustez

Validao

Um processo atravs do qual estudos de

laboratrio so utilizados para garantir que o
mtodo em questo atenda s exigncias desejadas

Tipo de mtodo
FDA. International Conference on Validation of Analytical Procedures: Definitions and Terminology; Availability. Federal Register. V. 60 (40)
p. 11260-11262, March, 1995.

Procedimento
analtico

Identificao

Teste de
Quantitativo

Impureza
Ensaio-limite

Doseamento

Exatido

No

Sim

No

Sim

No

Sim

No

Sim

No

Sim

No

Sim

Especificidade

Sim

Sim

Sim

Sim

LD

No

No

Sim

No

LQ

No

Sim

No

No

Linearidade

No

Sim

No

Sim

Faixa

No

Sim

No

Sim

Preciso
Repetitividade
Preciso
Intermediria

Parmetros de desempenho analtico a serem avaliados

Aplicabilidade
Faixa de trabalho
Linearidade
Homocedasticidade/heterocedasticidade
Faixa linear de trabalho
Sensibilidade
Limite de deteco
Limite de determinao/quantificao
Preciso (repetitividade, preciso intermediria e reprodutibilidade)
Exatido/Taxa de recuperao
Seletividade
Robustez

Aplicabilidade
Determinar qual ou quais matrizes e analito ou analitos para que o
mtodo analtico serviria,
Identidade do analito, incluindo especificao onde apropriado (p. ex:
arsnio total),
Faixa de concentrao coberta pela validao (p. ex: 0 50 mg/kg),
Uma especificao da faixa de matrizes do material teste coberta pela
validao (p. ex: frutos do mar),
Descrever o equipamento, reagentes, procedimento (incluir variao
permissvel p. ex: aquecer 1005C por 305min), procedimento de
calibrao e qualidade e, precauo de segurana especial necessria,
A aplicao pretendida e sua incerteza crtica (p. ex: anlise de
alimento para monitoramento). A incerteza padro u(c) do resultado c
deveria ser < 0,1 x c.
THOMPSON, M., ELLION, S. R. , WOOD, R. Pure and Applied Chemistry. V. 74, p. 835-855, 2002.

Faixa de trabalho

A faixa de trabalho (FT) pode ser definida entre

um dcimo a dobro do limite de restrio (LR)
0,1 . LR FT 2 . LR
FRAUNHOFER INSTITUT FR LEBENSMITTELTECHNOLOGIE UND VERPACKUNG Guide for testing of
analytical method for the determination of monomers in foods simulants and polymers. Mnchen. 3p. M&T Project
Development of methods of analysis. Printed papers.

Linearidade
a habilidade das respostas analticas serem diretamente
proporcionais s concentraes das substncias em estudo.
Ser verificada analisando em triplicata solues padro
com 6 ou mais concentraes diferentes, dispostas em um
intervalo estabelecido pela faixa de trabalho. Os valores
encontrados para confeco da curva analtica tm que
estar livres de valores aberrantes e os mesmos devem
apresentar homocedasticidade.

Clculo do ponto duvidoso na curva analtica

Pode-se verificar se algum ponto de concentrao desvia da

linearidade da curva por meio do clculo dos resduos entre os valores
medidos e os valores calculados a partir da equao da curva. Calcular
um ponto duvidoso de uma curva analtica pelo valor de t.
tcalculado= resduo
sr/n
Onde:

resduo = |xmedido - xcalculado|

sr =desvio padro dos resduos
n = nmero de pontos da curva

sr = (xmedido xcalculado)2
n-1

Procedimento para determinao da linearidade

Como o limite de restrio estabelecido pela
Resoluo 105 de 19-05-1999 da ANVISA/MS de
0,25% m/m de estireno na massa plstica, a faixa de
trabalho de 0,025 a 0,50% m/m

0,025 FT 0,50% m/m

Procedimento para determinao da linearidade

Considerando a massa tomada da amostra de
300mg, a faixa de concentrao na alquota
analisada seria de 7,5 a 150mg/L. Por praticidade,
fez-se a faixa de 10 a 150mg/L

Preparo da soluo me
Pesou-se 0,1066g de estireno com 99% de pureza.
Diluiu-se esta massa em balo volumtrico de
100mL com n-heptano. Considerando a pureza do
estireno 99%, o procedimento resultou em soluo
com concentrao de 1,055mg/mL

Preparo da solues de trabalho

Solues de trabalho
Com pipetas volumtricas, tomou-se alquotas
da soluo me para preparo das solues de
trabalho. Todas as alquotas foram avolumadas a
100mL com n-heptano

Volumes tomados da soluo me e concentrao das

solues de trabalho

Volume Tomado (mL)

Concentrao (mg/L)

0,00 10,55

21,10

52,75

10

105,5

Preparo da curva analtica

Os pontos de concentrao das solues de trabalho foram
analisados no cromatgrafo. As reas dos picos
correspondentes ao tempo de reteno do estireno em
relao aos pontos de concentrao foram medidos e, uma
curva analtica foi construda a partir das reas com seus
correspondentes pontos de concentrao das solues de
trabalho

Determinao da estabilidade da soluo me

De semana em semana retiramos uma alquota de 5mL da
soluo me de estireno em heptano e avolumamos com
heptano para 100mL em balo volumtrico. Tomamos uma
alquota desta soluo e injetamos em cromatgrafo a gs.
Observamos se o resultado da concentrao obtida
semelhante ao obtido inicialmente na confeco da curva
analtica

Homocedasticidade/heterocedasticidade

a independncia ou dependncia da varincia

das respostas com as concentraes do analito

Determinao da homocedasticidade
Analisou-se em triplicata todos os pontos da curva
analtica (10,55 105,5 mg/L), calculando em
seguida as varincias das respostas de cada ponto de
concentrao. Dividiu-se a maior varincia (S2) pelo
somatrio das varincias ( S2). O valor obtido
comparado com o valor tabelado
Varincia
S2 = 1/n-1 [xi X(mdio)]2

Homocedasticidade
Se o valor calculado for menor que o tabelado de
Cochran, o mtodo homocedstico. Portanto, a
curva analtica pode ser construda pelo mtodo dos
mnimos quadrados normais

C cal = S2 maior/ S2

Determinao da faixa de trabalho

Faixa de trabalho a faixa de concentrao do analito na
amostra que apresenta resposta linear com a concentrao

A faixa de trabalho(conc. na alquota de anlise 10,55105,5 mg/L) possibilitou detectar o estireno dentro dos
limites de interesse e a resposta do detector do
cromatgrafo conservou-se linear, que foi de 0,035 a 0,35
% m/m concentrao na amostra

Sensibilidade
Descreve quanto a resposta varia com a variao da
concentrao do analito. Pode ser expressa como a
inclinao da curva analtica (coeficiente angular),
expresso pala equao S=dx/dc, onde:
dx=variao da resposta, dc=variao da concentrao
medida ao mesmo tempo que testa a linearidade
Depende da natureza do analito e da tcnica de deteco
BRUCE, P. , MINKKINEN, P. , RIEKKOLA, M. L. Practical Method Validation: Validation sufficient for an Analysis
Method. Mikrochimica ACTA. V. 128, p. 93-106, 1998.

Limite de deteco LD

a mais baixa concentrao da substncia

em exame que pode ser detectada com um
certo limite de confiabilidade utilizando um
determinado procedimento experimental

Determinao do limite de deteco

O limite de deteco foi determinado analisando 6 vezes a
menor concentrao da curva analtica, e o desvio padro
foi multiplicado por 3, este limite referente a alquota de
anlise. Tem que se considerar o procedimento do mtodo
para se determinar o limite de deteco do mtodo.
Desvio padro: igual a raiz quadrada positiva da varincia
e tem a mesma dimensao da mdia aritmtica
S = 1/(n-1)[xi X(mdio)]2
THOMPSON, M., ELLION, S. R. , WOOD, R. Pure and Applied Chemistry. V. 74, p. 835-855, 2002.

Limite de determinao/quantificao LQ

a mais baixa concentrao da substncia em

exame que pode ser quantificada com certo limite
de confiabilidade utilizando um determinado
procedimento experimental

Limite de quantificao LQ

Geralmente o mais baixo ponto da curva

analtica no deve ser determinado por
extrapolao

UKAS PUBLICATION ref: LAB 27, United Kingdom Accreditation Service. www.ukas.com

Preciso
Repetitividade
Preciso intermediria
Reprodutibilidade

Repetitividade
o grau de concordncia entre resultados
de anlises individuais quando o
procedimento aplicado repetidamente
mltiplas anlises de uma mesma amostra
homognea, em idnticas condies de
teste.

Determinao da repetividade
Um mnimo de 9 determinaes cobrindo a faixa especfica
para o procedimento (p. ex: 3 concentraes/3 replicatas cada,
menor, intermediria e maior); ou
Um mnimo de 6 determinaes a 100 % de concentrao teste
Calcular o desvio padro, o desvio padro relativo ou
coeficiente de variao ou a varincia.
GUIDANCE FOR INDUSTRY Q2B. Validation of Analytical Procedures: Methodology U.S. Department of Health and Human
Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics evaluation and
Research, November 1996 ICH.

Preciso intermediria
Expressa as variaes dentro de um laboratrio,
como: dias diferentes, analistas diferentes,
mtodos diferentes, ou equipamentos diferentes,
sobre uma mesma amostra ou padro, definindo
exatamente quais as condies a variar (uma ou
mais)

Determinao da preciso intermediria

Os resultados dos dados obtidos em dias alternados, por
um mesmo analista, usando um mesmo equipamento,
mesmas concentraes e mesma metodologia, devero ser
o mesmo: pode ser comprovado por teste t, onde a hiptese
a ser afirmada que o resultado obtido em diferentes dias
so significativamente iguais.
Hiptese a ser testada: Ho: 1= 2
Teste t
T=( - xmed)/s.(n)-1 onde: =valor de referncia, xmed=mdia dos valores dos
resultados de anlise, n=nmero de resultados de anlise e s=desvio padro
O valor crtico (tabelado) varia em funo do grau de liberdade () e do nvel
de confiana, sendo que.
= n 1 Se: ttab > tcalcHo aceita
ttab< tcalcHo rejeitada

Reprodutibilidade
o grau de concordncia entre os resultados das medies
de um mesmo mesurando, efetuadas sob condies
variadas de medio(VIM).
A reprodutibilidade no um componente de validao de
mtodo executado por um nico laboratrio, obtido em
relao aos dados de validao obtidos atravs de
comparao interlaboratorial (INMETRO, 2002).
INMETRO. Orientaes sobre validao de mtodos de ensaio qumicos. DOQ-CGCRE-008, reviso:00-outubro 2002.
VIM Vocabulrio Internacional de termos Fundamentais e Gerais de Metrologia, 1995.

Exatido

a concordncia dos valores experimentais

com o valor verdadeiro X

Taxa de Recuperao
a relao entre o resultado experimental
obtido depois da anlise de uma amostra,
fortificada com uma quantidade conhecida
do analito, e o valor terico desta
quantidade fortificada

Determinao da taxa de recuperao

A taxa de recuperao ser calculada pela

diviso entre o resultado da concentrao
mdia experimental e a concentrao
terica multiplicada por 100.
Taxa recuperao=[conc. Exp./conc. Teor] x 100.

Seletividade
a interferncia por outra substncia, que
no seja o analito de interesse, na medio
pelo detector

Determinao da seletividade
Analisa-se trs vezes a soluo de estireno em heptano na
concentrao de (10,55mg/L) e depois analisa-se trs vezes
uma amostra que apresente na alquota de anlise uma
concentrao prxima a concentrao de (10,55mg/L) e
depois calcula-se o teste de igualdade de duas mdias de
amostras independentes (t)

Determinao da seletividade
O clculo do valor de t quando se comparam
mdias de duas amostras diferentes dado pela
expresso

t=

x1 x 2
Sa 1 / n1 1 / n2

Determinao da seletividade
Sa a estimativa do desvio padro agregado,
calculado a partir das estimativas dos desviospadres das duas amostras

Sa

(n1 1) S (n2 1) S
n1 n2 2
2
1

2
2

Robustez

a capacidade de um mtodo de no ser

afetado por uma pequena e deliberada
modificao em seus parmetros

Determinao da robustez

Resultados das amostras a 48 e 120 h

DEHA % m/m
48

120 h

0,286 0,306
0,270 0,325
0,276 0,329

DEHP % m/m
48
9,43
9,13
9,28

120 h
10,12
10,95
10,99

Determinao da robustez pelo teste t

Resultados da mesma amostra nos tempos de contato de 48 e 120
horas

Plastificantes
Desvio padro das diferenas
0,624
(%m/m)
Teste de igualdade de duas mdias
(%m/m)
T tabelado

DEHA

DEHP
0,020

3,760

3,910

4,303

4,303