Faculdade de Medicina
Histologia
Introduo
Testes at ento:
Monocamadas (in vitro).
Problemas:
No mantm integridade do tecido aps transplante;
Condrcitos so absorvidos aps transplante.
Introduo
Necessidade:
Muitos condrcitos;
Organizados em multicamadas.
Inovao:
Introduo
2 mtodos:
Fase nica: injeo de transplante;
2 estgios de transplante.
2 estgios:
1 fase: formao de neocartilagem e neopericndrio intraabdominal (6 meses).
2 fase: implante no tecido alvo.
Objetivos
Demonstrar que com FGF-2 h produo de cido
hialurnico - AH e a formao de um andaime in
vitro.
O AH se liga ao agrecano, proteoglicano cartilaginoso
componente da matriz extracelular MEC.
Demonstrar que no mtodo de 2 estgios h a
regenerao de neocartilagem e neopericndrio aps 6
meses de implantao intra-abdominal.
Materiais e Mtodos
Fontes de tecido cartilaginoso:
Reminiscncia de cartilagem auricular em cirurgias de
correo de microtia humana;
http://benplaa03.blogspot.com.br/
http://virtualmentor.ama-assn.org/2010/05/cprl1-
Materiais e Mtodos
Sistema de cultura de vrias camadas
Problema
Restos de cartilagem auricular;
Tratadas com 0,3% de colagenase;
Amostras agitadas por 4h, 37C;
Filtradas em clula peneira poro de 100m;
Isolamento de clulas.
Materiais e Mtodos
Sistema de cultura de vrias camadas
Clulas obtidas foram semeadas a uma densidade de
1 x 103 clulas/cm;
Resultou em 1.000 vezes mais clulas que cultura primria;
Estas foram semeadas em monocamadas de 2 x 10 4
clulas/cm;
Clulas semeadas 3 vezes em cima das previamente
cultivadas;
Processo se deu a cada 7 dias.
Materiais e Mtodos
Sistema de cultura de vrias camadas
densidade de 2 x 104 clulas/cm so inoculadas com um
total de 3 x 106 clulas/25mL em um frasco de 150 cm;
O processo repetido uma semana mais tarde num frasco de
150 cm;
Quantidade muito grande condrcitos so adquiridas com este
mtodo;
Trinta frascos de 150 cm de culturas multicamadas so usadas
por transplante em nica reconstruo de orelha.
Materiais e Mtodos
Meios de cultura
F-12;
DME;
Autoserum 10%*;
FGF-2, 10ng/mL;
Materiais e Mtodos
Meios de cultura
Penicilina G;
Sulfato de estreptomicina;
Anfotericina B, 2,5mg/mL;
Materiais e Mtodos
Ensaio de medio de AH
Mtodo de aglutinao de ltex;
Ltex adicionado ao meio;
Absorvncia de 800nm (Hitachi7170S; Tquio), concentrao
de AH.
Materiais e Mtodos
Transplante
Condrcitos multicamadas foram coletados e introduzidos
com uma seringa numa bolsa subcutnea da parede abdominal
inferior (4 semanas da cultura primria);
Decorreram 6 meses;
Retirado cirurgicamente um bloco de neocartilagem e
reimplantado no mesmo paciente para correo de microtia.
Materiais e Mtodos
Anlise histolgica e imuno-histoqumica
Materiais e Mtodos
Anlise histolgica e imuno-histoqumica
Imuno-histoqumica confirmou presena de colgenos tipo I e II.
Soluo de anticorpos humanos de colgeno tipo I, (Southern
Biotech);
Soluo de anticorpos humanos de colgeno tipo II, (Chemicon
Internacional).
40mg de anticorpos / 100mL
Anlise de varredura em microscopia eletrnica.
Materiais e Mtodos
Resultados
Obteno de clulas condrognicas;
Sob ao de FGF-2 aumento de 3 vezes;
Com isso comprovou-se o envolvimento do FGF-2 na
proliferao dos condrcitos elsticos;
AH aumentou consideravelmente em relao cultura
controle;
AH aumentou mais na cultura multicamada que na
monocamada.
Resultados
in vitro
Monocamada
Multicamada
Sobreposio celular;
Conexo de protuberncias
intercelulares;
Fentipo de condrcito.
Resultados
in vivo
Multicamada
Regenerao de neocartilagem;
Formando bloco de neopericndrio;
No houve adeso aos tecidos adjacentes, podendo ser colhida
como bloco nico;
Cor branca brilhante (caracterstico de cartilagem) rodeado
por neopericndrio.
Resultados
Metacromasia azul de toluidina
Presena de agrecano (proteoglicano);
Presena de colgeno tipo II, que comprova a formao de
cartilagem humana;
Presena de colgeno tipo I, que comprova a formao de
pericndrio humano;
Resultados
Colorao Elastica Van Gieson
Presena de fibras elsticas, em quantidade que comprova que
o bloco formado de cartilagem elstica;
Resultados
Colorao com azul de toluidina revela que
neocartilagem produziu uma
grande
quantidade de agrecano.
Resultados
Resultados
Resultados
Avaliao mecnica da neocartilagem (viscoelasticidade)
Neocartilagem
Neocartilagem
Aplicao clnica
Discusso
Discusso
Tentativas anteriores:
Discusso
Discusso
Outras vantagens:
Em multicamadas, os condrcitos produzem MEC;
Produzem AH;
Induzem rediferenciao de condrcitos;
Projetaram salincias e ligaram-se uns aos outros.
Discusso
Diferenas (MEC):
Monocamada X Multicamada
sem MEC
com MEC
Discusso
Confirmadas in vivo:
Presena de colgeno humano tipo II;
Fibras elsticas;
Confirmadas in vitro:
Induo de diferenciao;
Presena de colgeno tipo I no neopericndrio tal qual no
pericndrio auricular.
Discusso
Teste viscoelasticidade:
Neocartilagem
Neocartilagem
Discusso
2 estgios:
Regeneram MEC;
Desenvolvem neocartilagem com neopericndrio in vivo;
Referncias
http://benplaa03.blogspot.com.br/
http://virtualmentor.ama-assn.org/2010/05/cprl1-1005.html
http://www.encyclo.co.uk/define/autoserum&prev=/sear
ch%3Fq%3Dautoserum%26hl%3Dpt%26safe%3Doff%26biw%3D16
00%26bih%3D775&sa=X&ei=53pbUZ3YA-qE0QGjkIDoDw&ved=0C
EwQ7gEwBA
MUITO
OBRIGADO!!!