Mtodo de Breed

Recuentos directos al microscopio

Pedro Miguel Palacios Farfn
Microbiologa de los Alimentos

Es un mtodo en el que se puede

determinar el nmero de bacterias de una
muestra por examen microscpico directo.
El mtodo de tincin no diferencia los
organismos vivos de los muertos. El nmero
total obtenido se denomina nmero total
Se usa adems para el recuento de clulas
animales (predominante mente leucocitos)
que se encuentran en una proporcin
elevada en la leche obtenida durante la

Principio del Mtodo de

Breed
Para el planteo de este mtodo resulta

esencial que el microscopio este calibrado

de tal forma que se conozca el REA DEL
CAMPO VISUAL del mismo. Un volumen
conocido (0,01 ml) de la muestra se
extiende sobre un rea conocida (1 cm3) del
portaobjetos.
Se deja secar, luego se tie y se examina al
microscopio.
Se determina el nmero medio de bacterias
o clulas por campo y luego es posible
calcular as el nmero de m.o por ml. De la
muestra original.

Desarrollo del mtodo de

Breed

Determinacin del rea del campo del microscopio

1. Se prepara el microscopio y utilizando el ocular 10
X con objetivo de poco aumento se ajusta el
micrmetro de platina de forma que la escala
graduada quede en el centro. (1 mm dividido en
100 unidades de 10 cada una)
2. Se coloca una gota de aceite de inmersin sobre el
micrmetro de platina y se enfoca con el objetivo
de inmersin. Se determina el dimetro de campo
del microscopio, en micras, utilizando la escala de
micrmetro y ajustando la longitud del tubo de
microscopio ligeramente, si es necesario. Para
posteriores observaciones debe mantenerse la
misma longitud de tubo.

Determinacin del rea del campo del microscopio

3. Se calcula el rea del campo del microscopio, en mm, para el
objetivo de inmersin y ocular 10X, utilizando la frmula:

Donde : r = radio del campo

Conociendo el rea del campo del microscopio, es posible
determinar el factor del microscopio (MF)
4. Determinacin del factor del microscopio calculado :
a) MF = Nmero de campos en 1 cm2 ( 100 mm2)

b) Nmero medio n de organismos o clulas por campo.

Determinacin del rea del campo del microscopio

c) Nmero de organismos o clulas presentes en 1 cm 2

d) Nmero de clulas u organismos presentes en 1 ml de la

muestra.

En la mayora de los microorganismos, utilizados

como se indica; un microrganismo por campo
representa aproximadamente 500 000 organismos por
(ml) de la muestra.

Preparacin de la extensin
1. Se mezcla bien la muestra que se va a examinar.
2. Se coloca 0,01 ml de muestra sobre un porta
objeto limpio y se extiende sobre un rea de 1 cm2
utilizando una plantilla o un portaobjetos marcado.
La muestra puede depositarse bien sea:
a) Con una pipeta capilar calibrada para fracciones de 0,01
ml
b) Utilizando un asa. Un asa con 4 mm de dimetro interno
contiene aproximadamente 0,01 ml de muestra.

Preparacin de la extensin
3. Se seca la extensin inmediatamente colocndola
sobre una superficie horizontal caliente o en una
estufa a 55 C. Debe quedar completamente seca
antes de los 5 min para evitar una posible
multiplicacin bacteriana.
4. Se tie por mtodo adecuado.

Preparacin de la extensin
5. Se examina, utilizado objetivo de inmersin.

Recuento
1. Cada bacteria aislada se cuenta como una. Las
cadenas o grumos de bacterias tambin se cuenta
como unidades. Las bacterias separadas del grumo
una distancia superior, al eje mayor de las
bacterias que le constituyen, deben contarse como
separadas.

Recuento
De esta manera el recuento directo es tambin un
recuento de grumos y esta ms de acuerdo con los
resultados obtenidos por recuento de placa ya que
cada grumo o cadena probablemente dar origen a
una SOLA colonia.

Recuento
2. El nmero de campos que deben contarse puede
determinarse de acuerdo con el nmero medio de
bacterias que aparecen por campo, segn sugiri
Wilson (1935) y detallamos a continuacin:
Numero medio de
bacterias por campo

Nmero de campos
que deben contarse

0-3

64

4-6

32

7-12

16

13-25

26-50

51-100

Ms de 100

Recuento
2. Se determina el nmero medio de bacterias por
campo y de ah se calcula el nmero por mililitros
(ml).